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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 全式金的pEASY-EI载体和目的基因连不上
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connieba

新虫 (小有名气)

[求助] 全式金的pEASY-EI载体和目的基因连不上

做了很多次了，大小2.7kb的目的基因一直连不上pEASY-E1载体。感受态和载体确定都没有问题，步骤也完全按照说明书上的做的。转化Trans-T1感受态后涂Amp平板，能长出单菌落，但是挑取单菌落做菌落PCR都呈阴性。实在是找不到原因了，望好心人帮助~是实验手法的问题吗？之前也做过连接1.8Kb目的基因的，很顺利的就连上了~
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1楼 2012-09-21 11:01:46
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-21 14:26:39
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗？是的话先确保A尾。2.7K有些大了，其他都没有问题的话，试下延长连接时间，过夜较好，并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行，就换载体，推荐Promega的pGEM-T，我3.6K多的基因一连一个准。有时候选择贵一点的东西是没错的，不要贪图便宜方便。
       个人看法 若有说错请高手指点
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Let God do with it as He wills
2楼2012-09-21 13:52:28
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connieba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 13:52:28
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗？是的话先确保A尾。2.7K有些大了，其他都没有问题的话，试下延长连接时间，过夜较好，并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行，就换载体，推荐Pro ...

是载体哦，这个是买的全式金的试剂盒，连接速度比较快的，只要二十分钟就可以了，我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的，直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的，都没问题。
我是新手，请多指教~
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3楼2012-09-21 14:02:47
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
3楼: Originally posted by connieba at 2012-09-21 14:02:47
是载体哦，这个是买的全式金的试剂盒，连接速度比较快的，只要二十分钟就可以了，我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的，直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的，都没问题。
我是新手，请多指 ...

嗯...............
       ？为什么要液体回收，胶回收才对吧，液体中肯定有小分子量杂条带，会与大分子量条带竞争，就是胶回收都有这样的问题。30分钟对于3kb的条带太吃力了，如果试剂盒里边连接酶是T4的话，还是推荐过夜连接。
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Let God do with it as He wills
4楼2012-09-21 15:27:34
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connieba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 15:27:34
嗯...............
       ？为什么要液体回收，胶回收才对吧，液体中肯定有小分子量杂条带，会与大分子量条带竞争，就是胶回收都有这样的问题。30分钟对于3kb的条带太吃力了，如果试剂盒里边连接酶是T4的话，还是 ...

条带单一而且很亮，所以做的液体回收。那个是快速连接试剂盒，连接时间最长只要30min的哦。
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5楼2012-09-22 14:34:59
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yananhl

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by connieba at 2012-09-22 14:34:59
条带单一而且很亮，所以做的液体回收。那个是快速连接试剂盒，连接时间最长只要30min的哦。...

请问楼主现在连接问题解决了没，我现在也在用全式金的载体试剂盒，但是是T5，我连3000多点的片段，也是连接出问题，菌长的特别少。挑出来都是小片段，没有目的片段，请问你是怎么解决的呢，在这里感谢了！
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6楼2012-10-25 16:44:07
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connieba

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yananhl at 2012-10-25 16:44:07
请问楼主现在连接问题解决了没，我现在也在用全式金的载体试剂盒，但是是T5，我连3000多点的片段，也是连接出问题，菌长的特别少。挑出来都是小片段，没有目的片段，请问你是怎么解决的呢，在这里感谢了！...

没有哦，现在就直接放弃这个方法了……找不到问题出在哪里~希望你能解决问题啦……
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7楼2012-10-27 13:51:48
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summergca

铜虫 (初入文坛)
载体本身就有问题，我们用他们载体连接做过测序，存在污染，换载体吧
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8楼2012-11-30 17:23:46
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genius517

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 13:52:28
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗？是的话先确保A尾。2.7K有些大了，其他都没有问题的话，试下延长连接时间，过夜较好，并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行，就换载体，推荐Pro ...

链接的时候最好要轻拿轻放，再做一次试试
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9楼2014-04-18 13:41:54
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jmh5d

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by yananhl at 2012-10-25 16:44:07
请问楼主现在连接问题解决了没，我现在也在用全式金的载体试剂盒，但是是T5，我连3000多点的片段，也是连接出问题，菌长的特别少。挑出来都是小片段，没有目的片段，请问你是怎么解决的呢，在这里感谢了！...

层主，我和你一样的问题，请问你现在解决了吗
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希望实验可以顺顺利利
10楼2014-06-09 14:51:28
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