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connieba

新虫 (小有名气)

[求助] 全式金的pEASY-EI载体和目的基因连不上

做了很多次了,大小2.7kb的目的基因一直连不上pEASY-E1载体。感受态和载体确定都没有问题,步骤也完全按照说明书上的做的。转化Trans-T1感受态后涂Amp平板,能长出单菌落,但是挑取单菌落做菌落PCR都呈阴性。实在是找不到原因了,望好心人帮助~是实验手法的问题吗?之前也做过连接1.8Kb目的基因的,很顺利的就连上了~
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

引用回帖:
3楼: Originally posted by connieba at 2012-09-21 14:02:47
是载体哦,这个是买的全式金的试剂盒,连接速度比较快的,只要二十分钟就可以了,我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的,直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的,都没问题。
我是新手,请多指 ...

嗯...............
       ?为什么要液体回收,胶回收才对吧,液体中肯定有小分子量杂条带,会与大分子量条带竞争,就是胶回收都有这样的问题。30分钟对于3kb的条带太吃力了,如果试剂盒里边连接酶是T4的话,还是推荐过夜连接。
Let God do with it as He wills
4楼2012-09-21 15:27:34
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-21 14:26:39
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗?是的话先确保A尾。2.7K有些大了,其他都没有问题的话,试下延长连接时间,过夜较好,并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行,就换载体,推荐Promega的pGEM-T,我3.6K多的基因一连一个准。有时候选择贵一点的东西是没错的,不要贪图便宜方便。
       个人看法 若有说错请高手指点
Let God do with it as He wills
2楼2012-09-21 13:52:28
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connieba

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 13:52:28
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗?是的话先确保A尾。2.7K有些大了,其他都没有问题的话,试下延长连接时间,过夜较好,并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行,就换载体,推荐Pro ...

是载体哦,这个是买的全式金的试剂盒,连接速度比较快的,只要二十分钟就可以了,我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的,直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的,都没问题。
我是新手,请多指教~
3楼2012-09-21 14:02:47
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connieba

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 15:27:34
嗯...............
       ?为什么要液体回收,胶回收才对吧,液体中肯定有小分子量杂条带,会与大分子量条带竞争,就是胶回收都有这样的问题。30分钟对于3kb的条带太吃力了,如果试剂盒里边连接酶是T4的话,还是 ...

条带单一而且很亮,所以做的液体回收。那个是快速连接试剂盒,连接时间最长只要30min的哦。
5楼2012-09-22 14:34:59
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