24小时热门版块排行榜    

查看: 3639  |  回复: 10
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

connieba

新虫 (小有名气)

[求助] 全式金的pEASY-EI载体和目的基因连不上

做了很多次了,大小2.7kb的目的基因一直连不上pEASY-E1载体。感受态和载体确定都没有问题,步骤也完全按照说明书上的做的。转化Trans-T1感受态后涂Amp平板,能长出单菌落,但是挑取单菌落做菌落PCR都呈阴性。实在是找不到原因了,望好心人帮助~是实验手法的问题吗?之前也做过连接1.8Kb目的基因的,很顺利的就连上了~
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

genius517

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 13:52:28
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗?是的话先确保A尾。2.7K有些大了,其他都没有问题的话,试下延长连接时间,过夜较好,并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行,就换载体,推荐Pro ...

链接的时候最好要轻拿轻放,再做一次试试
9楼2014-04-18 13:41:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-09-21 14:26:39
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗?是的话先确保A尾。2.7K有些大了,其他都没有问题的话,试下延长连接时间,过夜较好,并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行,就换载体,推荐Promega的pGEM-T,我3.6K多的基因一连一个准。有时候选择贵一点的东西是没错的,不要贪图便宜方便。
       个人看法 若有说错请高手指点
Let God do with it as He wills
2楼2012-09-21 13:52:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

connieba

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-21 13:52:28
嗯......................
       这个pEASY-E1是T载体吗?是的话先确保A尾。2.7K有些大了,其他都没有问题的话,试下延长连接时间,过夜较好,并确保2.7K的回收条带纯度高。
       实在不行,就换载体,推荐Pro ...

是载体哦,这个是买的全式金的试剂盒,连接速度比较快的,只要二十分钟就可以了,我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的,直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的,都没问题。
我是新手,请多指教~
3楼2012-09-21 14:02:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

引用回帖:
3楼: Originally posted by connieba at 2012-09-21 14:02:47
是载体哦,这个是买的全式金的试剂盒,连接速度比较快的,只要二十分钟就可以了,我把时间延长到三十分钟还是不行的。P出来的条带都很亮的,直接液体回收后也用核酸定量仪测过纯度的,都没问题。
我是新手,请多指 ...

嗯...............
       ?为什么要液体回收,胶回收才对吧,液体中肯定有小分子量杂条带,会与大分子量条带竞争,就是胶回收都有这样的问题。30分钟对于3kb的条带太吃力了,如果试剂盒里边连接酶是T4的话,还是推荐过夜连接。
Let God do with it as He wills
4楼2012-09-21 15:27:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 上海工程技术大学激光智能制造课题组招收博士研究生 +6 两三岁ss 2026-09-14 6/300 2026-09-15 20:17 by 只吃肉葡萄
[博后之家] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 40ms4Wlo4umh 2026-09-14 3/150 2026-09-15 19:23 by CgyNCDVNhGVg
[考研] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 40ms4Wlo4umh 2026-09-14 3/150 2026-09-15 19:11 by CgyNCDVNhGVg
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 5/250 2026-09-15 16:59 by CgyNCDVNhGVg
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 5/250 2026-09-15 16:35 by CgyNCDVNhGVg
[公派出国] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 5/250 2026-09-15 14:58 by CgyNCDVNhGVg
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-15 14:50 by VMDqgnlKimtZ
[考博] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-15 14:25 by VMDqgnlKimtZ
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-15 14:14 by VMDqgnlKimtZ
[公派出国] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +7 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 9/450 2026-09-15 14:10 by VMDqgnlKimtZ
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 23jxep3nCNZb 2026-09-14 3/150 2026-09-15 09:38 by VMDqgnlKimtZ
[教师之家] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-15 08:26 by C79jjtjAKjEn
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 4/200 2026-09-15 08:02 by C79jjtjAKjEn
[找工作] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 4/200 2026-09-15 08:02 by C79jjtjAKjEn
[考博] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-15 07:58 by C79jjtjAKjEn
[博后之家] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 3/150 2026-09-15 07:34 by C79jjtjAKjEn
[教师之家] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 4/200 2026-09-15 07:02 by 5BDX0d0WFp7t
[硕博家园] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 5/250 2026-09-14 23:13 by vZfe6xYu34yj
[找工作] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 5/250 2026-09-14 21:25 by vZfe6xYu34yj
[教师之家] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:13 by Aj1rhIDL5ixY
信息提示
请填处理意见