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_然然

金虫 (正式写手)

[求助] 设计引物时引入了同尾酶,怎么办

之前设计引物没考虑过同尾酶的问题。所以用设计的引物pcr扩增,酶切连接后,测序,发现是反向连接,才发现设计的引物 上游是SalI ,下游是XhoI 。
然后挑了好多次单菌落了,都是反连。想问一下同尾酶在连接时有优势性吗?  如果没有的话,我是不是可以尝试把单菌落都挑了,然后pcr,看能否酶切开呢。
谢谢
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diandong

禁虫 (著名写手)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

2楼2012-09-13 16:46:20
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_然然

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by diandong at 2012-09-13 16:46:20
使用同尾酶可以节省酶的使用,再鉴定时需要用上游的其他酶。

这个怎么理解呀?
3楼2012-09-14 14:37:57
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xuyihui2001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
重新做吧!我认为有些片段就是容易偏好连接成反向,所以还是重新设计新的引物,用其它酶切位点吧!
4楼2012-09-14 15:50:47
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_然然

金虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by xuyihui2001 at 2012-09-14 15:50:47
重新做吧!我认为有些片段就是容易偏好连接成反向,所以还是重新设计新的引物,用其它酶切位点吧!

恩 已经重新设计引物了 呵呵
5楼2012-09-15 09:12:38
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wutidenggao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

唉,我就不能重新设引物了,载体上就那么几个酶切位点,片段中还占用了一部分,只能用同尾酶做了,我只有多挑一途了
将有限化为无限
6楼2012-11-01 20:59:44
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_然然

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wutidenggao at 2012-11-01 20:59:44
唉,我就不能重新设引物了,载体上就那么几个酶切位点,片段中还占用了一部分,只能用同尾酶做了,我只有多挑一途了

我头开始也是这么想的 不过做了两手准备 换酶切位点重新做还有就是继续挑单克隆,不过感觉它连接有倾向性,可能跟目的片段有关吧 现在是换了酶切位点之后已经做出来了  你的情况很复杂,好运!
7楼2012-11-02 09:14:37
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