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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » western blot 遇到困难 请求帮助！！！
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顽象

银虫 (小有名气)

[求助] western blot 遇到困难 请求帮助！！！

最近做western一直不顺  希望高手给予帮忙啊
我的目的蛋白是116KDa，51KDa 均是单抗， 内参是36KDa，    分离胶10%   浓缩胶是5% 蛋白电泳恒压50V 50min  90V 60min   三个蛋白一起转膜 恒压100V 2h   封闭2小时，  一抗、二抗均是1:500稀释，  一抗37℃摇床孵育1小时 4℃过夜，  二抗37℃摇床孵育1小时 显出的条带如图中： 116的蛋白在最上面 膜背景比较暗，而且出现杂带（但是我订购的abcam的说明书上是单抗的）；   51的那个蛋白条带比较暗，都看不太清楚条带；  最让人头疼的是内参（最下面的那个）竟然没条带 ；  这中间到底出现了什么原因呢？刚接触蛋白，做了几次，结果都不是很好，很是头疼，希望各位能给点指导意见，谢谢了！

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奋斗
1楼 2012-09-08 16:40:18
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顽象

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by linyingjia at 2012-09-11 21:19:03
做的和parp  p53  gadph  的位置差不多   

转膜用新配的转膜液   恒流 80ma（小转膜仪） 2.5-3h    应该都能转过来   

杂带可能 封闭的不好   或者抗体浓度太大啦   

上样量还是很重要的     我们50ug

...

好的 谢谢你。我们现在做的达到60ug了 内参有做过一次 出现了条带 但是不是很清楚   我们封闭了2个小时  或许应该是抗体浓度有点大吧   我现在考虑抗体浓度稀释个梯度做做怎么样
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奋斗
5楼2012-09-11 22:07:30
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gaorongbest

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+4, 应助指数+1 2012-09-11 10:06:38
哪几个是你的三个样？（除了Marker）；电泳的时候没问题，因为你的Marker都跑开了；转膜之前你有没有用丽春红染色看看蛋白条带？转膜的电压比较小，你的Marker都不是很清晰（还是你照相没照好），按常规来说，进口预染的Marker应该很清晰；转膜的时候是常温还是在低温条件下转的？有可能是温度原因；另外，你的电转液是新配的还是？（如果不是，可以用新的电转液试试）（相对来说，整个背景不深，说明你洗膜没问题），你试试我说的这些，看看有改变不
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2楼2012-09-10 10:58:52
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顽象

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaorongbest at 2012-09-10 10:58:52
哪几个是你的三个样？（除了Marker）；电泳的时候没问题，因为你的Marker都跑开了；转膜之前你有没有用丽春红染色看看蛋白条带？转膜的电压比较小，你的Marker都不是很清晰（还是你照相没照好），按常规来说，进口预 ...

好的 非常感谢。  用手机拍的 照片有点模糊，上面有三张膜，我拼在了一起 最上面的一条膜是116KDa，中间是51KDa  最下面是36的内参； 转膜前 我用的考马斯亮蓝染色效果很好的 条带很清晰， 您说的转膜电压比较小 我们实验室做蛋白的都是这个电压 然后根据自己的蛋白加长或减少转膜时间，最近看了有些人做恒流转膜 不知道效果怎么样，marker转膜后还是很清晰的，照相效果不是很好，转膜的时候是在冰上转膜的 仪器装置全都覆盖上了冰，电转液这个是新配的， 但是三条膜的背景不是一样的，是不是封闭不好或者一抗浓度有点大造成的？
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奋斗
3楼2012-09-10 15:27:02
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

做的和parp  p53  gadph  的位置差不多   

转膜用新配的转膜液   恒流 80ma（小转膜仪） 2.5-3h    应该都能转过来   

杂带可能 封闭的不好   或者抗体浓度太大啦   

上样量还是很重要的     我们50ug

内参没有带   可能是抗体的问题吧
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4楼2012-09-11 21:19:03
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