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western blot 遇到困难 请求帮助！！！
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最近做western一直不顺 希望高手给予帮忙啊 我的目的蛋白是116KDa，51KDa 均是单抗， 内参是36KDa， 分离胶10% 浓缩胶是5% 蛋白电泳恒压50V 50min 90V 60min 三个蛋白一起转膜 恒压100V 2h 封闭2小时， 一抗、二抗均是1:500稀释， 一抗37℃摇床孵育1小时 4℃过夜， 二抗37℃摇床孵育1小时 显出的条带如图中： 116的蛋白在最上面 膜背景比较暗，而且出现杂带（但是我订购的abcam的说明书上是单抗的）； 51的那个蛋白条带比较暗，都看不太清楚条带； 最让人头疼的是内参（最下面的那个）竟然没条带  ； 这中间到底出现了什么原因呢？刚接触蛋白，做了几次，结果都不是很好，很是头疼，希望各位能给点指导意见，谢谢了！ IMG0890A.jpg  IMG0891A.jpg |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+4, 应助指数+1 2012-09-11 10:06:38
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+4, 应助指数+1 2012-09-11 10:06:38
| 哪几个是你的三个样？（除了Marker）；电泳的时候没问题，因为你的Marker都跑开了；转膜之前你有没有用丽春红染色看看蛋白条带？转膜的电压比较小，你的Marker都不是很清晰（还是你照相没照好），按常规来说，进口预染的Marker应该很清晰；转膜的时候是常温还是在低温条件下转的？有可能是温度原因；另外，你的电转液是新配的还是？（如果不是，可以用新的电转液试试）（相对来说，整个背景不深，说明你洗膜没问题），你试试我说的这些，看看有改变不 |
2楼2012-09-10 10:58:52
3楼2012-09-10 15:27:02
linyingjia
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6楼2012-09-12 09:09:30
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7楼2012-11-01 12:07:45