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aloon111

金虫 (正式写手)

[求助] 多个基因如何连接?

有三个基因A,B,C,按顺序连接,引物均有酶切位点。连接PHT304载体。
请问接连方案:1:将三个基因依次连接到载体?
2:将三个基因连接后再连接到载体?
或其它连接方案?
先谢谢大虾们。
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汇天下之贤
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loop00

木虫 (小有名气)

阿凡达

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
aloon111: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-06 11:07:57
scelab: 金币+2, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-06 16:07:49
我觉得第一种比较保险,但是比较慢;第二种不用每一次都转化细菌提质粒,但是做的过程中了没有细菌可以养
坚强面对生活
2楼2012-09-06 10:39:55
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yasmineross

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
aloon111: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-06 11:08:13
看你的基因大小了,如果都是小基因,可以PCR拼起来,一次连到载体里;
如果基因大的话,可以分步连接。
3楼2012-09-06 10:40:37
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aloon111

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yasmineross at 2012-09-06 10:40:37
看你的基因大小了,如果都是小基因,可以PCR拼起来,一次连到载体里;
如果基因大的话,可以分步连接。

1500,750,710bp.。如何PCR拼起来?这技术如何掌握
汇天下之贤
4楼2012-09-06 10:47:15
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qurande

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
scelab: 金币+2, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-06 16:07:38
考虑一下overlap PCR
5楼2012-09-06 15:47:53
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yasmineross

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
scelab: 金币+3, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-06 16:07:29
引用回帖:
4楼: Originally posted by aloon111 at 2012-09-06 10:47:15
1500,750,710bp.。如何PCR拼起来?这技术如何掌握...

就是overlapPCR
两个基因连接处设的引物要有15-20bp的重合区,像你这三个基因完全可以拼接后一步连接到载体上。
6楼2012-09-06 15:54:22
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
注意每个基因要带启动子...
7楼2012-09-06 18:53:10
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aloon111

金虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-09-06 18:53:10
注意每个基因要带启动子...

如有2个基因,连接方案如下:
(1)启动子--ATG-基因1-基因2-TAA?
(2)启动子--ATG-基因1-TAA-ATG-基因2-TAA?
(3)启动子--ATG-基因1-TAA-启动子-ATG-基因2-TAA?
不知前面2种连接方法可不可行?
汇天下之贤
8楼2012-09-19 19:31:08
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-09-20 08:33:12
aloon111: 金币+4, ★★★很有帮助 2012-09-20 09:18:23
(1)启动子--ATG-基因1-基因2-TAA?表达出来fusion protein
(3)启动子--ATG-基因1-TAA-启动子-ATG-基因2-TAA?是表达出单个基因。
(2)启动子--ATG-基因1-TAA-ATG-基因2-TAA?只会表达出基因1
9楼2012-09-19 23:56:43
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