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apple712

银虫 (初入文坛)

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[求助] 5'race 求助，万分感激~~~

各位大侠好，最近在做5‘race。用的是cloneth的SmartRace kit，引物Tm值在70度附近，操作的步骤完全按照kit的进行：两次PCR过程中，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作nest PCR，68度退火，72延伸3min，25个cycles；看到有清晰的条带，大小跟我想要的size差不多，回收做连接测序，结果是26S ribosomal RNA gene的部分序列，重新提取RNA并进行检测，cDNA也做了检测，均没有问题。然后做了race，结果得到size差不多的条带，最后测序结果也是一样。奇怪的是所得到的序列中也找不到我做pcr的引物，请问问题出在哪里了？我需要怎样改进我的实验条件？因为是第一次做race，有很多都不懂，请大家指教。谢谢~

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1楼 2012-08-28 20:05:46

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游蓝达you

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

引用回帖:

4楼: Originally posted by apple712 at 2012-09-18 16:27:45
我刚刚做出来了，现在正在扩全长序列。RNA是用kit提的，质量挺好的，但是浓度不是很高，因为我提的那个物种本身就很难提。你也是用clontech的kit做的么，我之前虽然说是在用这个kit，其实是从网上下载人家的protoc ...

我昨天回来的5’RACE测序结果，也是比对出26S ribosomal RNA gene全部序列，而且特异性引物找不到。而且最近同时也在做另一个基因的保守区，今天的测序结果，找到引物位置了，放到NCBI上一比对，神奇般的又是26S ribosomal RNA gene 。现在彻底晕了，这样的巧合，是不是药品污染了呢？请问楼主上次的情况是怎么解决的？就是RACE的试剂盒换了一下就对了吗？心急啊....

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瓶子在试验。。。

11楼2013-05-27 22:29:53

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