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tztboy

新虫 (初入文坛)

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专业: 神经生物学

[求助] PCR 连接转化不长菌

最近在做克隆片段长度 1700bp左右，载体用的FLAG-P48，置换酶切后跑胶如下：

注：转化先将连接好的载体和片段（目的片段12微升洗脱七八微升，载体8微升洗脱 2微升连接）加入到在冰上融化的感受态细胞（纯质粒转化已验证感受态细胞工作良好），冰上放置20分钟，42°热激80-90S，再冰上放置2分钟，转化涂板（用的氨苄板，纯质粒转化工作）但是就是不长菌
请求各位大侠！急已经两个月了，做了好多次，换过好多条件

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1楼2012-08-27 17:30:34

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tztboy

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-27 20:20:28
楼主，你是直接用PCR产物酶切后在和FLAG-P48连接？如果是，楼主设计的引物在酶切位点前的碱基是否足够多？这个碱基数量很有可能会影响你PCR产物的酶切效果，从而不会产生粘性接头，所以无法与酶切后的载体连接。

一年半后才来回复您，非常谢谢您的帮助，现在所有的都工作正常了，具体问题还是没有找到，但是现在克隆做的超级顺利。非常感谢