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tztboy

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 连接转化不长菌

最近在做克隆 片段长度 1700bp左右,载体用的FLAG-P48,置换酶切后跑胶如下:注:转化先将连接好的载体和片段 (目的片段12微升洗脱七八微升,载体8微升洗脱 2微升连接 )加入到在冰上融化的感受态细胞(纯质粒转化已验证感受态细胞工作良好),冰上放置20分钟,42°热激80-90S,再冰上放置2分钟,转化涂板(用的氨苄板,纯质粒转化工作)但是就是不长菌
  请求各位大侠!急已经两个月了,做了好多次,换过好多条件
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duanbj_hxu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
赶快抢一个沙发坐坐
2楼2012-08-27 17:56:34
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主,你是直接用PCR产物酶切后在和FLAG-P48连接?如果是,楼主设计的引物在酶切位点前的碱基是否足够多?这个碱基数量很有可能会影响你PCR产物的酶切效果,从而不会产生粘性接头,所以无法与酶切后的载体连接。
麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起,么有鱼丸粗面。。那,我要鱼丸么有鱼丸那,我要粗面…………么有粗面那,我要鱼丸粗面……………………
3楼2012-08-27 20:20:28
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muscle920

禁虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
本帖内容被屏蔽

4楼2012-08-28 01:18:09
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遗落雪花

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你可以在热激冰浴后,加入无抗生素的培养基,再在37度摇床上摇培1小时左右,这样可以恢复菌的抗性,转速不要太高,150rpm左右。然后离心一下,留100ul的上清将沉淀混匀后,再涂板
5楼2013-07-10 09:43:50
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-27 20:20:28
楼主,你是直接用PCR产物酶切后在和FLAG-P48连接?如果是,楼主设计的引物在酶切位点前的碱基是否足够多?这个碱基数量很有可能会影响你PCR产物的酶切效果,从而不会产生粘性接头,所以无法与酶切后的载体连接。

保护碱基。
另外,不长菌的情况问题就很多了,建议做个阳性对照以排除分析问题。
伟大航线....
6楼2013-07-10 10:12:55
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tztboy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-27 20:20:28
楼主,你是直接用PCR产物酶切后在和FLAG-P48连接?如果是,楼主设计的引物在酶切位点前的碱基是否足够多?这个碱基数量很有可能会影响你PCR产物的酶切效果,从而不会产生粘性接头,所以无法与酶切后的载体连接。

一年半后才来回复您,非常谢谢您的帮助,现在所有的都工作正常了,具体问题还是没有找到,但是现在克隆做的超级顺利。非常感谢
7楼2014-03-09 13:04:13
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biocherry

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by tztboy at 2014-03-09 13:04:13
一年半后才来回复您,非常谢谢您的帮助,现在所有的都工作正常了,具体问题还是没有找到,但是现在克隆做的超级顺利。非常感谢...

遇到同样问题,克隆长不出来
8楼2014-08-22 11:14:53
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