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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR 连接转化不长菌
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tztboy

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR 连接转化不长菌

最近在做克隆 片段长度 1700bp左右，载体用的FLAG-P48，置换酶切后跑胶如下：注：转化先将连接好的载体和片段 （目的片段12微升洗脱七八微升，载体8微升洗脱 2微升连接 ）加入到在冰上融化的感受态细胞（纯质粒转化已验证感受态细胞工作良好），冰上放置20分钟，42°热激80-90S，再冰上放置2分钟，转化涂板（用的氨苄板，纯质粒转化工作）但是就是不长菌
  请求各位大侠！急已经两个月了，做了好多次，换过好多条件
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1楼 2012-08-27 17:30:34
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duanbj_hxu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
赶快抢一个沙发坐坐
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2楼2012-08-27 17:56:34
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主，你是直接用PCR产物酶切后在和FLAG-P48连接？如果是，楼主设计的引物在酶切位点前的碱基是否足够多？这个碱基数量很有可能会影响你PCR产物的酶切效果，从而不会产生粘性接头，所以无法与酶切后的载体连接。
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
3楼2012-08-27 20:20:28
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muscle920

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
4楼2012-08-28 01:18:09
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遗落雪花

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你可以在热激冰浴后，加入无抗生素的培养基，再在37度摇床上摇培1小时左右，这样可以恢复菌的抗性，转速不要太高，150rpm左右。然后离心一下，留100ul的上清将沉淀混匀后，再涂板
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5楼2013-07-10 09:43:50
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-27 20:20:28
楼主，你是直接用PCR产物酶切后在和FLAG-P48连接？如果是，楼主设计的引物在酶切位点前的碱基是否足够多？这个碱基数量很有可能会影响你PCR产物的酶切效果，从而不会产生粘性接头，所以无法与酶切后的载体连接。

保护碱基。
另外，不长菌的情况问题就很多了，建议做个阳性对照以排除分析问题。
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伟大航线....
6楼2013-07-10 10:12:55
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tztboy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-27 20:20:28
楼主，你是直接用PCR产物酶切后在和FLAG-P48连接？如果是，楼主设计的引物在酶切位点前的碱基是否足够多？这个碱基数量很有可能会影响你PCR产物的酶切效果，从而不会产生粘性接头，所以无法与酶切后的载体连接。

一年半后才来回复您，非常谢谢您的帮助，现在所有的都工作正常了，具体问题还是没有找到，但是现在克隆做的超级顺利。非常感谢
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7楼2014-03-09 13:04:13
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biocherry

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tztboy at 2014-03-09 13:04:13
一年半后才来回复您，非常谢谢您的帮助，现在所有的都工作正常了，具体问题还是没有找到，但是现在克隆做的超级顺利。非常感谢...

遇到同样问题，克隆长不出来
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8楼2014-08-22 11:14:53
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