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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR模板问题。
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fengyunqb

新虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR模板问题。

我是准备设计简并引物扩增一个鱼类的未知基因的保守区。一些文献上是提取脑部总RNA，然后反转录得到第一链CDNA,然后用这CDNA做模板扩增保守区。但是我老师的想法是直接提取DNA，然后用DNA做模板来扩增保守区。请问有经验的同学老师，这样可行否？各自的有缺点是什么？请不吝赐教。
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1楼 2012-08-24 15:36:50
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠

【答案】应助回帖

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fengyunqb: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-24 17:04:02
fengyunqb: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-09-11 11:10:55
在高等动植物中，DNA和RNA的区别在于，DNA是全基因序列含有内含子和外显子其扩增得到的序列不能有完整的ORF框架，RNA只含有外显子是一个完整的ORF框架。如果本实验的目的是先通过DNA扩增获得部分序列，然后通过DNA序列设计特异引物以cDNA为模板扩增目的基因是可行的，但是如果想直接从DNA序列里获得目的基因的mRNA序列这个肯定是不行的！因为你不可能直接从DNA序列中分析哪部分是外显子那部分是内含子。
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
2楼2012-08-24 16:32:06
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-24 16:32:06
在高等动植物中，DNA和RNA的区别在于，DNA是全基因序列含有内含子和外显子其扩增得到的序列不能有完整的ORF框架，RNA只含有外显子是一个完整的ORF框架。如果本实验的目的是先通过DNA扩增获得部分序列，然后通过DNA序 ...

恩。我就是想先扩增该基因的部分序列。我设计的简并引物是通过CDS多序列比对结果设计的。然后准备通过简并引物和模板先扩增出部分保守区。再做3'race和5'RACE拿到序列全长。提DNA做模板的话比提RNA做模板简单些？但是我那根据CDS设计的引物能P出东西来吗？
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3楼2012-08-24 17:03:52
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠

【答案】应助回帖

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fengyunqb: 金币+4 2012-09-11 11:11:02
引用回帖:
3楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-08-24 17:03:52
恩。我就是想先扩增该基因的部分序列。我设计的简并引物是通过CDS多序列比对结果设计的。然后准备通过简并引物和模板先扩增出部分保守区。再做3'race和5'RACE拿到序列全长。提DNA做模板的话比提RNA做模板简单些？但 ...

CDS设计是可以的，但是不能设计到内含子区段，所以如果有条件直接反转出cDNA，以cDNA作为模板，就能一劳永逸了
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
4楼2012-08-24 18:11:01
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