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张虎

木虫 (小有名气)

[求助] 特异性Promoter引物该怎么设计啊

小弟想请教各位高贤大仙一个关于Promoter引物设计的问题。
我想把在某一种细胞中特异性表达的基因的Promoter扩增出来，然后连接在适当的载体上并加上标记蛋白和荧光蛋白的表达序列，使这些目的蛋白依据Promoter的特异性表达在这种细胞中。但是小弟之前没有做过Promoter引物的设计，据说涉及到5‘UTR端的长度等问题，希望各路高人指点一二，不胜感激。
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1楼 2012-08-23 11:49:35
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tiani_tan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 张虎 at 2012-08-24 10:25:49
你好，多谢你的回答。
我在文献上查到某个基因的promoter时这么说“Reporter gene assay:  translational fusion, with 4 kb 5'UTR of str-1 and the first 4 amino acids of the protein.”  
请问4kb 5'UTR of ...

5’UTR指的就是从起始密码子往上数计算的，起始密码子的第一个A为+1，然后一直到-4kb。其实5‘UTR和CDS应该是重合了一部分。所以4kb应该从起始密码子开始算，基本上这一段区域已经包括了全部的顺式作用元件和大部分的增强子了，具体的需要进行启动子预测。网址我忘记了，你可以上网查查
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张虎
6楼2012-08-24 11:51:46
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tiani_tan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 七夕这么有空，积极鼓励 2012-08-23 15:52:30
张虎: 金币+5, ★有帮助 2012-08-24 09:35:05
启动子的扩增，模板是基因组DNA，需要将基因组DNA酶切后连上接头，以一个接头的序列为引物，目的基因内部序列为另一侧的引物，进行PCR扩增，有点类似于RACE，你可以参考一下文献，或者购买相关的试剂盒！！祝好运！
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2楼2012-08-23 12:26:59
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张虎

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tiani_tan at 2012-08-23 12:26:59
启动子的扩增，模板是基因组DNA，需要将基因组DNA酶切后连上接头，以一个接头的序列为引物，目的基因内部序列为另一侧的引物，进行PCR扩增，有点类似于RACE，你可以参考一下文献，或者购买相关的试剂盒！！祝好运！

你好，多谢你的回答！我们可能没有才哟娜你说的类似RACE的方法，我们设计的质粒上已经连接有目的蛋白和荧光蛋白的表达序列了，现在只需要把特异性Promoter扩增出来，连接T载体，之后按酶切位点需要切下来并连接在载体上。我就是想知道扩增这个Promoter的引物怎么设计，请您继续指教，谢谢！
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3楼2012-08-23 13:07:56
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tiani_tan

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
张虎: 金币+15, ★★★★★最佳答案 2012-08-24 09:35:55
首先，确定你的物种是否已经被报道，如果基因组已经知道的话，那么根据网上的序列设计引物，这里需要注意的是分析启动子最低片段是多少；含有顺式作用原件的区域有多长；含有增强子的序列有多少，可能最后需要获得几条大小不同的片段，需要构建几个载体，一一验证。
对于基因组未曾报道的序列，就比较复杂。就像我上文说的，需要用一些限制性内切酶将基因组酶切成小片段后，连接接头，然后利用接头上的一直序列和基因内部序列进行PCR扩增，然后测序，根据测序结果进行启动子预测，然后扩增含有不同区域的引物，验证功能。
建议还是搜集一下相关文献，我只是看过文献，实验室有人做过这方面的。但我自己没有做过。呵呵！！
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4楼2012-08-24 09:05:24
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