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soffy0214

铜虫 (小有名气)

[求助] 今天提了一天的RNA，结果在紫外下只看到一团黑色。求分析！

我很确定我的rna是提出来了的。我用甲醛变性胶，加2微升EB，胶是红色的。然后加10微升样电泳，样中加4微升甲醛，2微升上样缓冲液，2微升10倍的MOPS缓冲液。检测时什么都看不见，只在溴酚蓝的位置看到一团黑色的东西。A260和A280都是负值。我的RNA哪去了？求解！

[ Last edited by soffy0214 on 2012-7-19 at 08:24 ]
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1楼 2012-07-18 23:04:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-19 15:18:46
A260，280以及A260/280比值都可以用于分析RNA纯度。你的值都是负的，说明RNA降解了或没有提出来。你提出的白色沉淀有可能只是组蛋白，一般提出RNA应该是胶状和管差不多颜色而非白色沉淀，或者你获得的RNA量太多和部分蛋白沉淀在一起形成白色物，但是从你的A260，280值来看，是没有提出来。白色的应该是组蛋白，因为组蛋白溶解于水和稀酸。
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6楼2012-07-19 10:09:10
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普通回帖

jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你怎么确定你的RNA一定提出来了呢？然后就是你的跑胶条件是多少？
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2楼2012-07-19 08:38:47
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soffy0214

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-19 08:38:47
你怎么确定你的RNA一定提出来了呢？然后就是你的跑胶条件是多少？

因为有一团白色沉淀啊。加50微升的DEPC水后就溶解了。我使用trizol提的。60V，30min
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3楼2012-07-19 09:42:57
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soffy0214

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jl860822 at 2012-07-19 08:38:47
你怎么确定你的RNA一定提出来了呢？然后就是你的跑胶条件是多少？

即使是降解了，也不该没有任何痕迹啊。
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4楼2012-07-19 09:44:57
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by soffy0214 at 2012-07-19 09:44:57
即使是降解了，也不该没有任何痕迹啊。...

50μl水溶解，有点多吧，我以前就用大约一半的量，然后跑胶就150v左右跑10min不到，白色的沉淀应该不是你要的RNA
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5楼2012-07-19 09:51:44
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soffy0214

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-19 10:09:10
A260，280以及A260/280比值都可以用于分析RNA纯度。你的值都是负的，说明RNA降解了或没有提出来。你提出的白色沉淀有可能只是组蛋白，一般提出RNA应该是胶状和管差不多颜色而非白色沉淀，或者你获得的RNA量太多和部 ...

我还是按照以前的步骤，先用trizol溶液裂解，加氯仿，然后用异丙醇沉淀，请问哪一步出现问题会出现这种情况？这次可能是没提出RNA来，沉淀的颜色太白了，还很分散。
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7楼2012-07-19 13:31:15
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-20 13:39:39
其实我觉得降解的可能比较大，提多少肯定都能提出来。实验前，请问RNase AWAY把实验台等擦拭干净，操作过程中，每步也注意一下应该问题不大啊，只有再做一次看。实在不行找个你的师兄师姐的带你一起做一次。
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8楼2012-07-19 16:32:40
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sjjsy7

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-20 13:39:50
如果说你A260/A280是负值，那白色沉淀物很有可能是蛋白质，提RNA的前期准备很重要的，比如研钵和枪头最好用DEPC水泡一下，不然很容易降解掉！是在不行就让师兄弟带一下！
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9楼2012-07-19 19:37:11
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soffy0214

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by chenguestc at 2012-07-19 16:32:40
其实我觉得降解的可能比较大，提多少肯定都能提出来。实验前，请问RNase AWAY把实验台等擦拭干净，操作过程中，每步也注意一下应该问题不大啊，只有再做一次看。实在不行找个你的师兄师姐的带你一起做一次。

没有师兄师姐。降解了也会有弥散的带啊。不知道是不是试剂的问题。
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10楼2012-07-19 19:45:46
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