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fengyunqb

新虫 (小有名气)

[交流] 从鲫鱼大脑提取RNA ,有人有这方面的经验吗？

我想从鲫鱼大脑提取RNA，用兼并引物来扩增某个未知的基因。哪位大哥有这方面的实验经历嘛，偶是新手，提取RNA的经验，我的杀多少条鱼啊，谢谢有经验的战友给予建议。直接把头剪下来？谢谢给予指导。
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1楼 2012-07-15 11:30:23
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tupac225

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-07-16 13:41:38
fengyunqb: 金币+1 2012-09-11 11:10:03
取脑：打开头骨，用镊子取出鱼脑即可。
硫氰酸胍－酚－氯仿法在制备用于反转录PCR的RNA时最实用，建议用这种方法。其他的就是研磨鱼脑准备鱼脑的RNA提取，希望有帮助。
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fengyunqb
2楼2012-07-15 14:08:46
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-15 14:08:46
取脑：打开头骨，用镊子取出鱼脑即可。
硫氰酸胍－酚－氯仿法在制备用于反转录PCR的RNA时最实用，建议用这种方法。其他的就是研磨鱼脑准备鱼脑的RNA提取，希望有帮助。

你好，你真厉害，估计也做过。下面是我师兄做过斑马鱼的RNA提取。不知道我可不可以照搬。不过斑马鱼小，像手指头那么大。

1：斑马鱼、2：液氮冻死、3：剪头、4：缓冲液buffer研磨（冰上进行）、5：离心1400rpm、6：取沉淀、7：重复345、8：把沉淀放到裂解液（bufferB)、9：研磨、10：100000g离心、11：取上清12：100%TCA150ul混匀13：12000rpm 20min 弃上清14：加500ul丙酮15:37℃烘箱五分钟16：加入60ul Loading buffer 煮沸5min。。。

谢谢你的建议，我查了硫氰酸胍－酸性酚－氯仿法。网上有完整步骤。不过那个dT纤维柱得自己买，肯定要很多银子吧。谢谢你一直以来的帮助。
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3楼2012-07-15 16:08:08
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boyzoe

木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验，很热心哦 2012-07-16 13:42:10
fengyunqb: 金币+1 2012-09-11 11:10:08
给你个建议 少弄点材料 新手总是认为材料越多越好
头盖骨揭开就可以看到白色豆腐状的脑
鱼的脑分大 间 中 小 延五部脑 建议先看下鱼类解剖的资料
要是一起弄的话 体积会很大
一般提RNA 只要绿豆一半大的材料加1ml  trizol就行了
材料：trizol太多了的话 也会因裂解不完全引起降解的
扩基因的话 杀一条鱼即可

因为同是做鱼的 所以还是回一下 呵呵
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fengyunqb
4楼2012-07-15 21:22:13
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heroyl

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
取组织的别人都说了，我不再多说，我们提的时候是在trizol中放入组织后用匀浆器匀浆的，脑还算比较容易匀浆的吧，然后按照trizol法提的，还算比较简单吧，其它方法没试过，祝好！
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6楼2012-07-16 08:58:49
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by boyzoe at 2012-07-15 21:22:13
给你个建议 少弄点材料 新手总是认为材料越多越好
头盖骨揭开就可以看到白色豆腐状的脑
鱼的脑分大 间 中 小 延五部脑 建议先看下鱼类解剖的资料
要是一起弄的话 体积会很大
一般提RNA 只要绿豆一半大的材料加1 ...

非常感谢你的建议，我现在摸索初期，你的只言片语也会给我带来莫大的帮助，谢谢。没多少金币。

我得先去买两条鱼来试试手。有一个问题，我直接去菜场买鱼的话，怎么保证每次买的都是一样的鱼呢，即使是鲫鱼也会又不一样的品种吧。
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7楼2012-07-16 13:59:21
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by heroyl at 2012-07-16 08:58:49
取组织的别人都说了，我不再多说，我们提的时候是在trizol中放入组织后用匀浆器匀浆的，脑还算比较容易匀浆的吧，然后按照trizol法提的，还算比较简单吧，其它方法没试过，祝好！

哈哈，谢谢你的帮助。也祝你好运。
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8楼2012-07-16 14:00:27
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boyzoe

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by fengyunqb at 2012-07-16 13:59:21
非常感谢你的建议，我现在摸索初期，你的只言片语也会给我带来莫大的帮助，谢谢。没多少金币。

我得先去买两条鱼来试试手。有一个问题，我直接去菜场买鱼的话，怎么保证每次买的都是一样的鱼呢，即使是鲫 ...

鱼的脑结构都差不多 品种间差异就更小了
所以不用在意品种的差别
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fengyunqb
9楼2012-07-16 18:00:39
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fengyunqb

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by boyzoe at 2012-07-16 18:00:39
鱼的脑结构都差不多 品种间差异就更小了
所以不用在意品种的差别...

我是要克隆RNA哦， 扩增鲫鱼脑内某个特定的基因，所以要保证年龄，品种一样吧。。这样才有说服力，才会少一些意外因素是吗/
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10楼2012-07-17 09:26:38
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strive1231235楼
2012-07-15 21:53   回复  
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