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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请问贴壁细胞用什么固定液固定、固定多长时间~~
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马龙sweeting

木虫 (正式写手)

[求助] 请问贴壁细胞用什么固定液固定、固定多长时间~~

请问贴壁细胞用什么固定液固定、固定多长时间~~我固定后是要进行染色检测凋亡和坏死~~查文献有在染完色再固定的，用的是甲醇和冰醋酸~~但不知道固定多长时间~~请高手指教~~
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1楼 2012-07-10 11:50:44
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yangliguo007

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+2, 鼓励分享和交流 2012-07-10 23:51:57
不明白你什么意思，检测凋亡的话一般用PI染色，然后流式细胞仪检测，具体步骤为：
1、收集细胞；
2、用PBS洗3次；
3、离心，去上清，之后加500ulPBS重选，之后加入10ml70%乙醇于-20℃固定过夜；
4、离心，去乙醇，加入PI（含RNase），4℃避光孵育30min，之后上机检测
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物竞天择，适者生存。
2楼2012-07-10 21:20:29
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蓝天_1988

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+2, 鼓励新虫发帖交流 2012-07-12 09:38:27
4%的多聚甲醛15min；甲醇好像是1h，记得不是很清楚。建议用多聚甲醛。
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3楼2012-07-11 17:08:16
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zwzlysh

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
silicare: 金币+3, 鼓励新虫发帖交流 2012-07-12 09:38:37
建议用AO-EB双染色，细胞不需要固定，染出来的效果也非常好，凋亡细胞和正常细胞区别明显。
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4楼2012-07-11 17:16:02
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dongxie1982

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
yqbter: 金币+2, 鼓励发帖！ 2012-08-07 20:38:57
lz应该是采用原位细胞凋亡检测细胞凋亡(TUNEL法)？按照promge公司试剂盒进行操作就可以，先爬片24h后，用含4%多聚甲醛的PBS在室温下固定25分钟，后用PBS洗5分钟(浸泡)，重复2次。
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5楼2012-07-13 16:03:29
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马龙sweeting

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yangliguo007 at 2012-07-10 21:20:29
不明白你什么意思，检测凋亡的话一般用PI染色，然后流式细胞仪检测，具体步骤为：
1、收集细胞；
2、用PBS洗3次；
3、离心，去上清，之后加500ulPBS重选，之后加入10ml70%乙醇于-20℃固定过夜；
4、离心，去乙醇 ...

请问您说的PBS洗3次是怎么洗~~是将细胞重悬后，10000r，离心5min，再收集沉淀，这样算一次洗涤~~还是就是加入PBS，在不是细胞飘起来的情况下，浸泡一下细胞团块儿呢~~
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6楼2012-08-07 15:19:25
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cccssszzz08

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我们这里测凋亡和坏死的时候一般都是双染法测的。PI和AnexinV
大概的步骤是
1、调整待检测细胞浓度为106个/ml，取200ul， 1000rpm×5min(4℃)。

2、预冷的PBS1ml 润洗两次2，1000rpm×5min(4℃)。

3、将细胞重悬于100ul binding buffer，加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml)，轻轻混匀，避光冰上放置15分钟。

4、转至流式检测管，加入400ulPBS，每个样品临上机前加入1ulPI（50ug/ml），2分钟后迅速检测。

5、同时以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作为阴性对照。
这里说的PBS洗  就是直接在贴壁的情况下，然后就会传代的时候用PBS洗是一样的。
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好好学习天天向上
7楼2012-08-07 22:20:56
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