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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：Xho 1 单酶切 载体连接
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匿名

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1楼 2012-06-25 00:30:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR产物连T载体，再切下来，回收，再连接。载体：2ul(约0.03pmol)，片段：4ul(约0.003pmol)，这个mol比到1:3么？加大片段的量啊
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相信自己
2楼2012-06-25 08:37:29
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ruobing_008

新虫 (小有名气)
我觉得单酶切比双酶切难
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17楼2012-10-18 16:43:34
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刘仁坤2013

新虫 (小有名气)
引物上设计XHO1的酶切位点，进行PCR，把PCR产物和全式金公司的pEASY-T1 Simple载体连接，然后在用XHO1切割重组的质粒，跑胶，回收目的片段。这样得到的片段肯定是被XHO1酶切过的了。若不进行TA克隆，直接切割PCR产物，你不能确定其是否被XHO1酶切。
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19楼2013-06-18 15:13:28
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普通回帖

匿名

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3楼2012-06-25 12:59:51
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陈朵朵

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-25 13:46:38
之前我们实验室做简单的T载体连接，做了半个月也一直连不上，后来把T载体换了新的，T4连接酶也换了之后就连上了。你看是不是你们的T载体污染了，一般T载体连接效率是很高的，跟mol比没有太大的关系，1:3 到1:10基本上没什么区别。
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4楼2012-06-25 13:04:44
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by nxtaoxu at 2012-06-25 12:59:51
有，都1:10了。...

你是片段：载体=1：10啊？要载体：片段=1：10
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相信自己
5楼2012-06-25 14:10:19
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匿名

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6楼2012-06-25 14:18:16
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zhqu1234

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能xhoI有外切酶污染，推荐换管酶试试。我之前有个载体构建了三个月都连接不上，换了另一个公司的内切酶一次就连上了。
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7楼2012-06-25 19:21:17
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zw198626

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助，很热心哦 2012-06-26 16:38:52
nxtaoxu: 金币+5 2012-10-18 16:46:59
建议两点：
1.看看Xho I说明书，fermentas酶切位点是不是要当平末端来做连接（Takara的是这么个情况）？
2.质粒验证还是对的？
3.抗性还对？
4.该质粒在大肠杆菌中是否有泄漏表达，而表达该蛋白对大肠杆菌有细胞毒性？
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8楼2012-06-25 20:32:39
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amilie030312

金虫 (正式写手)
一般不会是链接时候的问题，估计是前面酶切的时候出问题了，换家公司的内切酶试试吧。
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9楼2012-06-26 13:42:31
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匿名

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10楼2012-06-26 14:10:16
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