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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助：Xho 1 单酶切 载体连接
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我是小纯洁

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换个公司的酶，推荐promega，前一阵我也遇到这样的问题 后来换了酶，一次成功。
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11楼2012-06-26 14:36:56
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yipianye69

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-06-27 13:44:35
同样推荐Promega公司的，连接效率确实很高，常温快连，16度或4度过夜都挺好的，
另外就是一点要保证被连接片段的质量！
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12楼2012-06-27 11:53:45
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

载体能切开说明酶没有问题，涂板子不长说明去磷酸化没有问题。载体，酶没有问题，那问题只可能是出在片段上，是不是没加保护碱基还是其他什么原因没切开？另外片段的量多点好，不用管那个1:10的比例，我都是100ul PCR体系的产物全部用来做连接。
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13楼2012-06-28 13:57:07
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jqq1985

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果片段也没问题了，那最大的问题就是连接酶了。
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14楼2012-06-28 13:58:21
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sk_yb

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在连接时，加大载体的量和连接酶的量。电转化是加大连接产物的量。电转完复苏半小时再涂板，一般就没有问题了。
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15楼2012-06-28 14:03:05
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匿名

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16楼2012-06-28 15:09:57
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ruobing_008

新虫 (小有名气)
我觉得单酶切比双酶切难
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17楼2012-10-18 16:43:34
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匿名

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18楼2012-10-18 16:51:06
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刘仁坤2013

新虫 (小有名气)
引物上设计XHO1的酶切位点，进行PCR，把PCR产物和全式金公司的pEASY-T1 Simple载体连接，然后在用XHO1切割重组的质粒，跑胶，回收目的片段。这样得到的片段肯定是被XHO1酶切过的了。若不进行TA克隆，直接切割PCR产物，你不能确定其是否被XHO1酶切。
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19楼2013-06-18 15:13:28
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匿名

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20楼2013-06-18 18:57:29
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