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关于WB的问题
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本人做的两个月WB 最后都没有想要的结果。明天打算从跑一次电泳 完整的再做一次看看。（本人大二，知识储备不足，谅解....） 有几个问题想问大家： 1.提取蛋白后（一共提了3份：①、②是转染我要的质粒后的细胞裂解蛋白，浓度分别是 3.3和3.8，③是未转染直接提取的阴性对照，浓度很高，是5.2）........请问我上样时 应该加多少微升，导师说是上15微升 那是3个样品保证质量相同还是体积相同？ 2.蛋白提取了300微升 每次取100微升加20微升的β-巯基乙醇，沸水中煮8分钟，请问β-巯基乙醇作用是什么 ，为什么要沸水煮。。。还有就是我每次取蛋白取完以后又把剩下的放进去 然后下次又取。。。这样反复冻融对蛋白有没有影响？ 做了两个月了。。一开始是空白 啥都没有 后来是非特异条带特别亮 不管是阳性还是阴性，就是没有要的目的条带。感觉砖模和跑胶都不错。昨天换了抗体 说明书上说的是1:3000- 1:8000都行 我用1:2000做了上周转上的PVDF模，结果今天看了结果还是白版。。。无解了都…………只好今晚在从新跑胶………………   |
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