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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ELISA同一样品，稀释倍数越高，得到结果越大？为嘛？
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liushan09

铜虫 (小有名气)

[求助] ELISA同一样品，稀释倍数越高，得到结果越大？为嘛？

ELISA检测血清样品中蛋白含量。常规过程。
同一样品不同稀释倍数得到结果差别较大，并且是随着稀释倍数越大越大，根据标准曲线计算出的结果就越大，这是什么个情况？
PS：之前也有碰到过，以为是稀释时混合不够均匀的问题，后一段时间没做，这次的结果又出现在这个问题。之前做倍比稀释，这次是3倍稀释。
Sample ID Loc        Dilution        Blank Data Calc Conc
SMP02        A4        20        0.386        3378.65
        B4        60        0.32        7141.63
        C4        180        0.194        10934.7
        D4        540        0.108        17991.7
        [Ave]                0.252        9861.67
百思不得其解啊。。谁能给些意见建议，先在此谢过啦~
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1楼 2012-06-18 14:55:38
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merryhan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by liushan09 at 2012-06-21 23:37:04
目的蛋白是类似于人抗体的蛋白，小鼠血清中本没有。小鼠给药后，采血取血清进行ELISA检测。
标准曲线是用KC Junior软件进行四参数拟合的结果。4楼附上了标准曲线的例子。
29/c8/851166_1340292997_248.jpg
...

1.你的稀释倍数是根据理论血药浓度推算的吗？
2.这个情况的可能原因是你给小鼠注射药后，药物在体内产生了抗药性抗体，在这种情况下是稀释倍数越大，值越高。
3.还有一种情况是你用的这个方法有HOOK效应，在这种情况下也是稀释倍数越大，值越高，但是当稀释倍数够大，这种效应就不会影响到结果。
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7楼2012-06-22 20:29:16
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lliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
liushan09: 回帖置顶 2012-06-23 16:24:29
抗原抗体结合存在有最佳比例关系。
如果抗原（或抗体）初始浓度太高，抗原与抗体之间的浓度差别过大，就会出现如此现象。随着进一步的稀释，便会出现关系曲线。当浓度低于一定范围，反应关系消失。

所以，Elisa检测的线性关系，仅适用于一定的浓度范围。
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2楼2012-06-21 11:36:58
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merryhan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

标准曲线是自己做的吗？你测的血清样品中的蛋白是什么物质啊？是血清中本来就有的东西还是输入动物体内的啊？楼主没有说明白啊。
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3楼2012-06-21 15:38:43
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lliu at 2012-06-21 11:36:58
抗原抗体结合存在有最佳比例关系。
如果抗原（或抗体）初始浓度太高，抗原与抗体之间的浓度差别过大，就会出现如此现象。随着进一步的稀释，便会出现关系曲线。当浓度低于一定范围，反应关系消失。

所以，Elisa ...

ELISA体系是之前实验人员建立的，标准曲线采用软件进行四参数拟合，举例如图。
又想了想出现上述情况可能的原因：
1、样品稀释
2、从低浓度到高浓度加样，不换枪头
3、标准曲线的形状。落在高吸光值区间，稍一点偏差对结果影响就很大。因此在稀释倍数准确的情况下，落在标准曲线变化急剧区域数据更准确。即吸光值小的部分结果准确。
1、2现在基本可以排除。这两次进行了自认为非常充分的稀释过程。之前加样也是低浓度到高浓度不换枪头。所以，3的可能性比较大。
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4楼2012-06-21 23:30:10
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