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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ELISA同一样品，稀释倍数越高，得到结果越大？为嘛？
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liushan09

铜虫 (小有名气)

[求助] ELISA同一样品，稀释倍数越高，得到结果越大？为嘛？

ELISA检测血清样品中蛋白含量。常规过程。
同一样品不同稀释倍数得到结果差别较大，并且是随着稀释倍数越大越大，根据标准曲线计算出的结果就越大，这是什么个情况？
PS：之前也有碰到过，以为是稀释时混合不够均匀的问题，后一段时间没做，这次的结果又出现在这个问题。之前做倍比稀释，这次是3倍稀释。
Sample ID Loc        Dilution        Blank Data Calc Conc
SMP02        A4        20        0.386        3378.65
        B4        60        0.32        7141.63
        C4        180        0.194        10934.7
        D4        540        0.108        17991.7
        [Ave]                0.252        9861.67
百思不得其解啊。。谁能给些意见建议，先在此谢过啦~
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1楼 2012-06-18 14:55:38
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lliu at 2012-06-21 11:36:58
抗原抗体结合存在有最佳比例关系。
如果抗原（或抗体）初始浓度太高，抗原与抗体之间的浓度差别过大，就会出现如此现象。随着进一步的稀释，便会出现关系曲线。当浓度低于一定范围，反应关系消失。

所以，Elisa ...

ELISA体系是之前实验人员建立的，标准曲线采用软件进行四参数拟合，举例如图。
又想了想出现上述情况可能的原因：
1、样品稀释
2、从低浓度到高浓度加样，不换枪头
3、标准曲线的形状。落在高吸光值区间，稍一点偏差对结果影响就很大。因此在稀释倍数准确的情况下，落在标准曲线变化急剧区域数据更准确。即吸光值小的部分结果准确。
1、2现在基本可以排除。这两次进行了自认为非常充分的稀释过程。之前加样也是低浓度到高浓度不换枪头。所以，3的可能性比较大。
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4楼2012-06-21 23:30:10
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by merryhan at 2012-06-21 15:38:43
标准曲线是自己做的吗？你测的血清样品中的蛋白是什么物质啊？是血清中本来就有的东西还是输入动物体内的啊？楼主没有说明白啊。

目的蛋白是类似于人抗体的蛋白，小鼠血清中本没有。小鼠给药后，采血取血清进行ELISA检测。
标准曲线是用KC Junior软件进行四参数拟合的结果。4楼附上了标准曲线的例子。
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5楼2012-06-21 23:37:04
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liushan09

铜虫 (小有名气)
十一点半了，罪过罪过~好好睡觉才是王道。
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6楼2012-06-21 23:40:01
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by merryhan at 2012-06-22 20:29:16
1.你的稀释倍数是根据理论血药浓度推算的吗？
2.这个情况的可能原因是你给小鼠注射药后，药物在体内产生了抗药性抗体，在这种情况下是稀释倍数越大，值越高。
3.还有一种情况是你用的这个方法有HOOK效应，在这种 ...

初涉这个领域，很多东西都不太了解。还请多多赐教。先在此谢过~
1、关于理论血药浓度与我的稀释倍数：
实验采用ICR小鼠，给药剂量为5mg蛋白/kg体重，药液体积为100ul/20g体重，皮内注射。于注射后0.5h、1h、2h、4h、6h、24h等取血。不知该如何计算理论血药浓度，是根据小鼠全血量和皮内注射这种给药方式的生物利用度吗？
我的稀释倍数是参考之前做其他蛋白皮内给药时的经验稀释倍数。但第一次做的时候，稀释倍数过大（从100X、200X开始做倍比），做8个倍比稀释只有1~2个倍数在标准曲线范围内甚至会全部梯度超限。因此后续实验调整了稀释倍数，从20X开始做倍比。
2、抗药性抗体：
小鼠都只给过一次药物。在48h采血时，已经能产生抗体了吗？
为什么产生抗药性抗体后，ELISA检测时，稀释倍数大，值就越高呢？
我该如何检测是不是产生了抗药性抗体呢？
3、HOOK效应：
先百度学习了下此效应。。此效应是说明标准曲线的浓度梯度设计不合理吗？标准品的浓度偏高了？

这个ELISA方法是从别人手中接过来直接重复的，只知操作，思考不足。。
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8楼2012-06-24 14:01:25
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liushan09 at 2012-06-24 14:01:25
初涉这个领域，很多东西都不太了解。还请多多赐教。先在此谢过~
1、关于理论血药浓度与我的稀释倍数：
实验采用ICR小鼠，给药剂量为5mg蛋白/kg体重，药液体积为100ul/20g体重，皮内注射。于注射后0.5h、1h、2h、 ...

实验采用的是双抗夹心的方法
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9楼2012-06-24 14:29:30
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liushan09 at 2012-06-24 14:01:25
初涉这个领域，很多东西都不太了解。还请多多赐教。先在此谢过~
1、关于理论血药浓度与我的稀释倍数：
实验采用ICR小鼠，给药剂量为5mg蛋白/kg体重，药液体积为100ul/20g体重，皮内注射。于注射后0.5h、1h、2h、 ...

1、标准品浓度稍做调整之后标准曲线见附图，之前从500ng/ml开始，现在的是从300ng/ml开始。标准曲线只是出现了S曲线的上半段，是不是意味着可以在将标准品浓度降低，尽量延长其线性区间？（现在的直线范围可视为0.03-0.1，或者0.03-0.13.）
2、样品的结果，见附图
选择OD值落在0.03-0.13之间的数据。这样结果可信么？
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10楼2012-06-24 15:00:50
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liushan09 at 2012-06-24 14:01:25
初涉这个领域，很多东西都不太了解。还请多多赐教。先在此谢过~
1、关于理论血药浓度与我的稀释倍数：
实验采用ICR小鼠，给药剂量为5mg蛋白/kg体重，药液体积为100ul/20g体重，皮内注射。于注射后0.5h、1h、2h、 ...

1、标准品浓度稍做调整之后标准曲线见附图，之前从500ng/ml开始，现在的是从300ng/ml开始。标准曲线只是出现了S曲线的上半段，是不是意味着可以在将标准品浓度降低，尽量延长其线性区间？（现在的直线范围可视为0.03-0.1，或者0.03-0.13.）
2、样品的结果，见附图
选择OD值落在0.03-0.13之间的数据。这样结果可信么？
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11楼2012-06-24 15:01:28
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by merryhan at 2012-06-26 13:39:05
1.你将标曲图纵坐标用线性，横坐标用log，这样得到的图是S形曲线。
2.你的标曲的OD值范围和定量范围分别是多少？看你的标曲图感觉准确度挺低的，应该测得的点基本都在标线上。...

昨天将标准品浓度范围扩大，做了标准曲线，横坐标用log，纵坐标用线性。
浓度设置、OD以及标准曲线如下：
1、常规S曲线是指以横坐标浓度用log，纵坐标OD用线性吗？我看我们这边软件上设置的相反的，横标准用的线性，纵坐标log了。哪种方式是对的呢？
2、做出来S曲线的线性范围可以视作300~18.75吗？
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14楼2012-06-28 08:21:00
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by merryhan at 2012-06-26 13:39:05
1.你将标曲图纵坐标用线性，横坐标用log，这样得到的图是S形曲线。
2.你的标曲的OD值范围和定量范围分别是多少？看你的标曲图感觉准确度挺低的，应该测得的点基本都在标线上。...

另将之前的数据采用横log纵线性处理了下，也是类似线性的关系。
但是，样品不同稀释倍数间数值存在差别这个问题还是存在。可能是稀释倍数的影响，或者是样品中血清的影响。
我现在做的消除血清干扰的方法：在标准品的稀释的过程中引入血清作为内标，比如20X稀释（这个稀释倍数尽量与样品的第一个稀释倍数相同），10STD+10血清+180稀释液，目的在于采用血清替换标准品溶液环境。后续稀释与标准品相同，采用倍比稀释。作为内标。结果处理：根据标准曲线拟合出的方程和内标的OD，给出内标的计算值。用计算值除以实值，得出一个系数。
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15楼2012-06-28 08:33:01
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