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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ELISA同一样品，稀释倍数越高，得到结果越大？为嘛？
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liushan09

铜虫 (小有名气)

[求助] ELISA同一样品，稀释倍数越高，得到结果越大？为嘛？

ELISA检测血清样品中蛋白含量。常规过程。
同一样品不同稀释倍数得到结果差别较大，并且是随着稀释倍数越大越大，根据标准曲线计算出的结果就越大，这是什么个情况？
PS：之前也有碰到过，以为是稀释时混合不够均匀的问题，后一段时间没做，这次的结果又出现在这个问题。之前做倍比稀释，这次是3倍稀释。
Sample ID Loc        Dilution        Blank Data Calc Conc
SMP02        A4        20        0.386        3378.65
        B4        60        0.32        7141.63
        C4        180        0.194        10934.7
        D4        540        0.108        17991.7
        [Ave]                0.252        9861.67
百思不得其解啊。。谁能给些意见建议，先在此谢过啦~
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1楼 2012-06-18 14:55:38
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by merryhan at 2012-06-26 13:39:05
1.你将标曲图纵坐标用线性，横坐标用log，这样得到的图是S形曲线。
2.你的标曲的OD值范围和定量范围分别是多少？看你的标曲图感觉准确度挺低的，应该测得的点基本都在标线上。...

另将之前的数据采用横log纵线性处理了下，也是类似线性的关系。
但是，样品不同稀释倍数间数值存在差别这个问题还是存在。可能是稀释倍数的影响，或者是样品中血清的影响。
我现在做的消除血清干扰的方法：在标准品的稀释的过程中引入血清作为内标，比如20X稀释（这个稀释倍数尽量与样品的第一个稀释倍数相同），10STD+10血清+180稀释液，目的在于采用血清替换标准品溶液环境。后续稀释与标准品相同，采用倍比稀释。作为内标。结果处理：根据标准曲线拟合出的方程和内标的OD，给出内标的计算值。用计算值除以实值，得出一个系数。
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15楼2012-06-28 08:33:01
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lliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
liushan09: 回帖置顶 2012-06-23 16:24:29
抗原抗体结合存在有最佳比例关系。
如果抗原（或抗体）初始浓度太高，抗原与抗体之间的浓度差别过大，就会出现如此现象。随着进一步的稀释，便会出现关系曲线。当浓度低于一定范围，反应关系消失。

所以，Elisa检测的线性关系，仅适用于一定的浓度范围。
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2楼2012-06-21 11:36:58
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merryhan

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

标准曲线是自己做的吗？你测的血清样品中的蛋白是什么物质啊？是血清中本来就有的东西还是输入动物体内的啊？楼主没有说明白啊。
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3楼2012-06-21 15:38:43
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liushan09

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lliu at 2012-06-21 11:36:58
抗原抗体结合存在有最佳比例关系。
如果抗原（或抗体）初始浓度太高，抗原与抗体之间的浓度差别过大，就会出现如此现象。随着进一步的稀释，便会出现关系曲线。当浓度低于一定范围，反应关系消失。

所以，Elisa ...

ELISA体系是之前实验人员建立的，标准曲线采用软件进行四参数拟合，举例如图。
又想了想出现上述情况可能的原因：
1、样品稀释
2、从低浓度到高浓度加样，不换枪头
3、标准曲线的形状。落在高吸光值区间，稍一点偏差对结果影响就很大。因此在稀释倍数准确的情况下，落在标准曲线变化急剧区域数据更准确。即吸光值小的部分结果准确。
1、2现在基本可以排除。这两次进行了自认为非常充分的稀释过程。之前加样也是低浓度到高浓度不换枪头。所以，3的可能性比较大。
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4楼2012-06-21 23:30:10
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