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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 转化真菌后，怎么鉴定转化子？目的基因是从该真菌克隆出来的
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sunny_andy

金虫 (小有名气)

[交流] 转化真菌后，怎么鉴定转化子？目的基因是从该真菌克隆出来的 已有2人参与

从某真菌克隆出目的基因，将其置于强启动子下，然后再转化到该真菌本身，那么如何鉴定转化子呢？
      转化真菌的话，转化的质粒全都是会整合到该真菌染色体上吗？
      表达载体上有潮霉素抗性，我能否直接设计潮霉素基因的引物，用转化子的基因组DNA来扩增潮霉素，如果扩增出来就是转化成功，这种鉴定方法可行吗？
    （ 转化时有对照，以水代替质粒，对照平板没有长。）
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1楼 2012-06-11 19:51:37
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asznpb

木虫 (正式写手)
强启动子作为探针做southern杂交或者是PCR检测呗，前者能确定拷贝数，但是时间长，后者很快做好，但是假阳性的可能也有很多
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显微镜下的世界很精彩！
2楼2012-06-11 20:47:53
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sunny_andy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by asznpb at 2012-06-11 20:47:53
强启动子作为探针做southern杂交或者是PCR检测呗，前者能确定拷贝数，但是时间长，后者很快做好，但是假阳性的可能也有很多

发好一点的文章是不是还是要Southern 鉴定啊
PCR是潮霉素基因？  因为我转化的是本来那个真菌里面的基因，只是加了强启动子再转化进去的
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3楼2012-06-11 20:59:47
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asznpb

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by sunny_andy at 2012-06-11 20:59:47
发好一点的文章是不是还是要Southern 鉴定啊
PCR是潮霉素基因？  因为我转化的是本来那个真菌里面的基因，只是加了强启动子再转化进去的...

额，一般来说是需要Southern杂交的结果，不过你也可以做个荧光定量PCR看看表达也行&……
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显微镜下的世界很精彩！
4楼2012-06-11 22:30:27
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glucidum

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
LZ这个事通常分4步进行鉴定:
(1)拟转化初筛CR法进行拟转化子检测，潮霉素抗性基因和目标基因都需要检测。对于LZ新导入的目标基因，可以设计一对跨启动子区和目标基因区的引物，这样就不会扩增出内源片段了。
(2)Southern杂交鉴定转化子
(3)Nouthern杂交或RT-QPCR检测目标基因RNA表达水平
(4)目标蛋白表达水平检测：分离纯化目标蛋白或检测活性（如果有）
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5楼2012-06-12 07:26:30
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sunny_andy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by glucidum at 2012-06-12 07:26:30
LZ这个事通常分4步进行鉴定:
(1)拟转化初筛CR法进行拟转化子检测，潮霉素抗性基因和目标基因都需要检测。对于LZ新导入的目标基因，可以设计一对跨启动子区和目标基因区的引物，这样就不会扩增出内源片段了。
(2 ...

(1)拟转化初筛CR法进行拟转化子检测，潮霉素抗性基因和目标基因都需要检测。对于LZ新导入的目标基因，可以设计一对跨启动子区和目标基因区的引物，这样就不会扩增出内源片段了。

我觉得这个不错，简单快速，另外我的有活性，检测一下 与野生菌比较  后面要做纯化
  谢谢大家！
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6楼2012-06-12 14:36:48
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