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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 纤维素酶高产菌株筛选时的透明圈问题
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mc2840261

新虫 (初入文坛)

[求助] 纤维素酶高产菌株筛选时的透明圈问题

小弟在做纤维素酶高产菌株的诱变选育，采用羧甲基纤维素钠刚果红培养基，但是透明圈很不明显，基本上就比菌落大个1mm……想求助下各位大侠，到底是什么原因，有没有改进的方法，能让透明圈变的大点~
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其实不幸福，其实还爱她，只是无法说出口
1楼 2012-06-06 17:39:00
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yhjcwangyw

铁杆木虫 (正式写手)
mc2840261: 回帖置顶 2012-06-12 10:47:33
这是我当时用的培养基
羧甲基纤维素钠（CMC）培养基（参考察氏培养基，用羧甲基纤维素钠取代其中的蔗糖，通过观察培养基上的菌落生长情况以及水解圈的大小和清晰程度，并经反复试验后，最终确定羧甲基纤维素钠添加量为0.8%，并在其中添加适量氯霉素以抑制细菌和放线菌的生长，其余配方不变；CMC不易溶于水，在配制该培养基时，加入CMC后，需在80℃的水浴锅中加热2h并不断搅拌使CMC充分溶解。）
CMC  0.8% ，NaNO3  0.3%， KCl  0.05%， K2HPO4  0.1%，FeSO4  0.001%，
MgSO4•7H2O  0.05%， 琼脂 2%，氯霉素 0.005%，pH 6.0 ,115℃灭菌15min
刚果红实验步骤待所点菌种在CMC平板上长出可见菌落后，往平板里加入适量1mg/ml的刚果红溶液，染色1h后，弃去染色液，并同时用蒸馏水清洗，最后加入适量1mol/L的NaCl溶液，脱色1小时，观察水解圈直径与菌落直径的大小。
附件中试我当时做的图片
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    • 2012-06-08 09:40:36, 1.08 M
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11楼2012-06-08 09:40:39
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yhjcwangyw

铁杆木虫 (正式写手)
★
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖交流 2012-06-07 23:01:44
哥们，俺研究生就做和你一样的课题。
首先，在配置羧甲基纤维素培养基时，将羧甲基纤维素钠加入到培养基中然后加热至八十摄氏度，一直搅拌，直至羧甲基纤维素钠溶解为止。
其次，千万别在培养基中加刚果红，我也做过的，水解圈效果不明显，刚果红抑制微生物生长。
应该是在未加刚果红的培养基上培养微生物，待微生物菌落长大后，添加1mg/ml的刚果红溶液浸泡半个小时后，用NaCl溶液浸泡后，用蒸馏水冲洗，透明全就出来了
祝福你
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4楼2012-06-07 17:45:50
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north_coco887

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖交流 2012-06-07 23:01:35
好像是利用纤维素酶扩散的原理，产酶量高，扩散的范围就大，会不会和琼脂浓度有关系呢？以前做过一点儿，后来不用了。不是降解CMC-Na的都能产纤维素酶。
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2楼2012-06-07 14:09:46
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mc2840261

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by north_coco887 at 2012-06-07 14:09:46
好像是利用纤维素酶扩散的原理，产酶量高，扩散的范围就大，会不会和琼脂浓度有关系呢？以前做过一点儿，后来不用了。不是降解CMC-Na的都能产纤维素酶。

那这样的话，第一步的初筛就没办法进行着……琼脂的浓度是2%,应该影响不大吧，而且我做的如果刚果红的浓度太高的话，会抑制菌的生长，现在的主要问题就是透明圈很不明显，有没有什么解决的办法呢？
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其实不幸福，其实还爱她，只是无法说出口
3楼2012-06-07 15:24:01
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mc2840261

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yhjcwangyw at 2012-06-07 17:45:50
哥们，俺研究生就做和你一样的课题。
首先，在配置羧甲基纤维素培养基时，将羧甲基纤维素钠加入到培养基中然后加热至八十摄氏度，一直搅拌，直至羧甲基纤维素钠溶解为止。
其次，千万别在培养基中加刚果红，我也做 ...

首先很感谢你！但是你说的我做过了！染色法染不出来……所以才去用直接加到培养基里面的方法，我培养的是真菌，菌长呢，但是染色后不出现透明圈，刚果红的浓度一样，而且我染了1个小时呢，不过用Nacl后没有用水洗，这个会不会有影响呢？或者说我的那个步骤错了呢？ 能否帮我分析下呢？我实在是没办法了，拜托了！！
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其实不幸福，其实还爱她，只是无法说出口
5楼2012-06-07 21:15:46
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zhenjiangjin

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励回帖交流 2012-06-07 23:01:52
用氯仿熏蒸破坏细胞壁，让酶流出胞外，再保温，试试。
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6楼2012-06-07 21:37:35
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mc2840261

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhenjiangjin at 2012-06-07 21:37:35
用氯仿熏蒸破坏细胞壁，让酶流出胞外，再保温，试试。

虽然听起来有些困难，不过我去试试吧~多谢~
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其实不幸福，其实还爱她，只是无法说出口
7楼2012-06-07 23:04:39
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506787376
8楼2012-06-08 00:00:32
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two

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mc2840261: 金币+2, ★有帮助, 木办法了！估计就是菌的问题吧 2012-06-12 11:47:39
说明你的菌种不行呀，哥们儿！重筛吧！俺们就是直接筛，大的很呀。
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努力快乐着,但生活本不如意
9楼2012-06-08 09:06:42
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yhjcwangyw

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by mc2840261 at 2012-06-07 21:15:46
首先很感谢你！但是你说的我做过了！染色法染不出来……所以才去用直接加到培养基里面的方法，我培养的是真菌，菌长呢，但是染色后不出现透明圈，刚果红的浓度一样，而且我染了1个小时呢，不过用Nacl后没有用水洗， ...

我当时也是培养的真菌（霉菌），首先你确定你培养的真菌能分解羧甲基纤维素钠吗，分解能力很强吗？如果培养的真菌不能分解羧甲基纤维素钠的话，你后面做的再好也不会出现透明圈的，其次你的培养基呢，一定要保证羧甲基纤维素钠完全溶于培养基中才行。
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10楼2012-06-08 09:32:53
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