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liumangtu403

铁虫 (小有名气)

[求助] 关于5‘RACE已有1人参与

各位高手：
         本人最近用clontech 做5'RACE,经过克隆测序确定是我要的序列，并且系列两端找到了相应的引物序列，同时也找到了接头序列。但是这个片段比网上的公布的序列要短（该序列目前仅有RNA ID,没有基因名），我想请问，是否连上接头的就一定是全长？如何确定扩出片段是全长？  盼回复!谢谢!
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1楼2012-04-25 21:38:10
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
自己顶一下，各位高手请不吝赐教！
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2楼2012-04-25 22:13:29
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-04-25 22:51:10:
用的是smart吧？个人感觉smart容易在连续几个G的位点加上接头.....反正我做是失败了

我的序列扩出的最5‘没有连续的几个G，但下游10bp处有几个连续的G，有影响吗？

另外问一下，怎么知道是失败了(就是你怎么知道扩出的不是全长)?
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4楼2012-04-26 12:50:47
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
liumangtu403: 回帖置顶 2012-04-27 14:00:32
liumangtu403: 取消置顶 2012-04-27 14:01:24
引用回帖:
5楼: Originally posted by vickie20 at 2012-04-26 14:06:05:
楼主，你5'端的引物是用primer primer5.0设计的吗？能告诉我怎么设计吗？

用primer 3设计的， 就是根据说明书上的TM>70  ，长度23-28  GC% 50-70
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6楼2012-04-26 19:31:49
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
liumangtu403: 回帖置顶 2012-04-27 14:00:52
各位，有没有人有办法证明扩出片段是全长，或真名扩出片段不是全长，还有就是网上公布的RNA（目前没有基因名）序列是不是一定是对的？很多文献都提到一个新基因通过RACE确定长度是多少多少，他们是怎么确定自己扩出的是全长的？纠结啊....不知道还要不要继续做这个片段的RACE，各位高手给我一点指导......万分感谢
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7楼2012-04-26 20:39:56
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
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8楼: Originally posted by XOooZzz at 2012-04-26 21:53:59:
没有扩出想要的基因。挑了两条带测序，发现在别的基因中间有连续g的地方加上了接头。
不知道怎么判断是不是全长呢...不过如果要的是mRNA，但找不到起始密码子就肯定不是全长。

我觉得会不会是剪切变体呢？  
另外我要的片段是ncRNA, 没法子预测......
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11楼2012-04-27 13:49:56
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
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10楼: Originally posted by vickie20 at 2012-04-27 09:27:21:
5'端的两个引物都是下游引物吧？在设计的时候上游引物以及产物大小这些参数是不是就不用管了？如何知道这两个下游引物跟接头引物的匹配分数呢？

5‘RACE 不是只要一个特异性引物吗？设计一个下游引物就可以了（可以多设计几个备用）；你如果要看接头引物跟你设计引物的匹配情况，个人认为只要用DNAMAN 、oligo之类的软件分析一下就行了。
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12楼2012-04-27 14:00:13
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
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13楼: Originally posted by 脱水拂空 at 2012-04-27 14:39:49:
你可以将得到的序列 再重新设计全长引物重新扩一下 然后再重新分析ORF部分就知道是不是全长啦

用全长引物扩不是只能证明片段有这么长，但不能证明片段不只是这么长....不知道我理解的有没有误

另外我的片段是non-coding RNA,原则上应该没有ORF或只有短的ORF......
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14楼2012-04-27 17:57:53
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liumangtu403

铁虫 (小有名气)
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15楼: Originally posted by 分子菜鸟 at 2012-04-28 09:47:04:
楼主用的什么酶？我实验室有同学曾经用比较差的taq酶做RACE结果就不太好，后来换了好一点的酶就发现差酶扩出的片段中间比好酶少了一大段。还有一种可能也是我见到过的，这个mRNA被选择性的剪切了，它可能有两种以 ...

我用的是TITANIUM™ Taq DNA  Polymerase, 是比较好的酶，应该没有没有问题吧.....现在觉得RACE就算辛苦做出来也不知道是不是真的。。。很无语。。。
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16楼2012-05-04 16:49:06
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