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weandyouzhy木虫 (小有名气)
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PCR的引物扩增后会被降解掉吗？
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一般的DNA复制完成时，RNA引物会被降解掉。那么在pcr扩增反应中。Taq酶会不会将引物链剪切掉呢？另外，能不能详细的介绍下PCR中所加试剂的量的原因。谢谢了 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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weandyouzhy
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6楼2012-04-07 20:31:18
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【答案】应助回帖
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应该是不会的，因为在你跑胶的时候会发现在最顶端还是有引物条带存在的，而且Taq酶均具有5'-3'聚合酶活性，但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除错配，切平末端；5'-3'外切酶活性可以消除合成障碍。 PCR试剂中的量： 1.首先要看你的体系是多少ul，规划好引物、模板、dNTP、酶和Buffer的量，其余用水补齐。 2.引物一般是要过量的，这样才能保证PCR能够在设定的循环里面跑完，一般浓度是uM。 3.模板一般就是ng级别的就可以了，主要是能保证前期引物可以与其结合。 4.dNTP的话一般都是mM级别的，它的浓度要比较大，保证反应顺利进行。 5.酶的话说明书上一般都会提到，按它的活性和单位来加就可以了。 6.Buffer要根据你的总体积，将储备浓度换算成最终的1X的就可以了。 祝好运！ |
3楼2012-04-07 14:56:00
imyting
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【答案】应助回帖
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weandyouzhy: 回帖置顶 2012-04-07 20:23:00
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weandyouzhy: 回帖置顶 2012-04-07 20:23:00
| 答案是否定的，Taq酶不具有水解引物的能力，不然的话PCR还如何继续，或者是你如何控制Taq酶发挥作用？PCR条件中有考虑这方面的吗？此外，在拿PCR产物跑胶时，有时能看到明显的引物二聚体条带，这也说明引物不会被降解。PCR体系中各组分的量基本是围绕酶和模板确定的，Buffer是10×的，当然加总体积的十分之一了，Mg离子的浓度关系到Taq酶的活力也是确定的，引物的浓度只要达到一定程度就好了，过多会产生二聚体之类的，过少影响PCR反应启动，模板也是的，多了也不好纯化啊，酶的话一般都有推荐量的，一定的体积加上那么多的酶就能满足要求了。而且酶的说明书也没有明确说其活力如何，只是给出在一定条件下的PCR结果罢了，只是参考。 |
4楼2012-04-07 15:04:58