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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


[求助] 荧光定量PCR

最近做了一次定量PCR标准曲线,用的染料法,做出来之后的结果很不理想,阴性对照荧光值特别高,求各位大侠帮我看看是污染原因还是引物本身的问题,由于本人是新手,对分子生物学实验相当缺乏经验,现在十分迷茫,不知怎么继续,实验结果如下图:

荧光曲线图



溶解峰



溶解曲线
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 有道理! 2012-04-04 22:25:55
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶,同时最好先做下普通PCR摸索条件,做荧光PCR摸索条件太浪费钱
2楼2012-04-04 19:14:47
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶,同时最好先做下普通PCR摸索条件,做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢,其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序,电泳条带很清晰,而且没有非特异性产物,只是有淡淡的引物二聚体条带,所以才试着做的定量,定量产物跑胶也是同样的情况,不过阴性对照也有条带
3楼2012-04-04 20:36:08
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶,同时最好先做下普通PCR摸索条件,做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢,其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序,电泳条带很清晰,而且没有非特异性产物,只是有淡淡的引物二聚体条带,所以才试着做的定量,定量产物跑胶也是同样的情况,不过阴性对照也有条带
4楼2012-04-04 20:36:21
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶,同时最好先做下普通PCR摸索条件,做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢,其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序,电泳条带很清晰,而且没有非特异性产物,只是有淡淡的引物二聚体条带,所以才试着做的定量,定量产物跑胶也是同样的情况,不过阴性对照也有条带
5楼2012-04-04 20:36:30
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶,同时最好先做下普通PCR摸索条件,做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢,其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序,电泳条带很清晰,而且没有非特异性产物,只是有淡淡的引物二聚体条带,所以才试着做的定量,定量产物跑胶也是同样的情况,不过阴性对照也有条带
6楼2012-04-04 20:36:42
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


消锦lzhy: 回帖置顶 2012-04-04 20:40:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶,同时最好先做下普通PCR摸索条件,做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢,其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序,电泳条带很清晰,而且没有非特异性产物,只是有淡淡的引物二聚体条带,所以才试着做的定量,定量产物跑胶也是同样的情况,不过阴性对照也有条带,就是不懂为啥阴性对照荧光值反而那么高,还有引物二聚体的问题不知道怎么解决,是不是必须换引物?求大侠指教!
7楼2012-04-04 20:39:37
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, Good! 2012-04-04 22:26:11
引用回帖:
6楼: Originally posted by 消锦lzhy at 2012-04-04 20:36:42:
非常感谢,其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序,电泳条带很清晰,而且没有非特异性产物,只是有淡淡的引物二聚体条带,所以才试着做的定量,定量产物跑胶也是同样的情况,不过阴性对照也有条带

阴性有条带的原因可能是引物二聚体,也就是说,引物以自己为模板把自己扩增出来了。所以只要有引物,就会有曲线,无论是什么对照。看你的溶解曲线,不也是有俩峰吗?可能就是二聚体的峰和产物的峰
8楼2012-04-04 21:01:33
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nakice

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
对于引物二聚体可以适当提高TM值,另外在设计引物时应尽量避免,可以用DNAMAN看一下引物的二聚体形成情况
奋斗就是生活,人生只有前进
9楼2012-04-06 10:56:34
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
9楼: Originally posted by nakice at 2012-04-06 10:56:34:
对于引物二聚体可以适当提高TM值,另外在设计引物时应尽量避免,可以用DNAMAN看一下引物的二聚体形成情况

非常感谢
10楼2012-04-07 11:25:17
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