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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量PCR

最近做了一次定量PCR标准曲线，用的染料法，做出来之后的结果很不理想，阴性对照荧光值特别高，求各位大侠帮我看看是污染原因还是引物本身的问题，由于本人是新手，对分子生物学实验相当缺乏经验，现在十分迷茫，不知怎么继续，实验结果如下图：

荧光曲线图



溶解峰



溶解曲线
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1楼 2012-04-04 16:21:37
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 有道理！ 2012-04-04 22:25:55
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶，同时最好先做下普通PCR摸索条件，做荧光PCR摸索条件太浪费钱
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2楼2012-04-04 19:14:47
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶，同时最好先做下普通PCR摸索条件，做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢，其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序，电泳条带很清晰，而且没有非特异性产物，只是有淡淡的引物二聚体条带，所以才试着做的定量，定量产物跑胶也是同样的情况，不过阴性对照也有条带
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3楼2012-04-04 20:36:08
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶，同时最好先做下普通PCR摸索条件，做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢，其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序，电泳条带很清晰，而且没有非特异性产物，只是有淡淡的引物二聚体条带，所以才试着做的定量，定量产物跑胶也是同样的情况，不过阴性对照也有条带
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4楼2012-04-04 20:36:21
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶，同时最好先做下普通PCR摸索条件，做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢，其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序，电泳条带很清晰，而且没有非特异性产物，只是有淡淡的引物二聚体条带，所以才试着做的定量，定量产物跑胶也是同样的情况，不过阴性对照也有条带
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5楼2012-04-04 20:36:30
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶，同时最好先做下普通PCR摸索条件，做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢，其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序，电泳条带很清晰，而且没有非特异性产物，只是有淡淡的引物二聚体条带，所以才试着做的定量，定量产物跑胶也是同样的情况，不过阴性对照也有条带
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6楼2012-04-04 20:36:42
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
消锦lzhy: 回帖置顶 2012-04-04 20:40:49
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-04-04 19:14:47:
从图看来可知道你的体系模板加多了。其次是引物有非特异性扩增或者是二聚体。建议对扩增产物跑胶，同时最好先做下普通PCR摸索条件，做荧光PCR摸索条件太浪费钱

非常感谢，其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序，电泳条带很清晰，而且没有非特异性产物，只是有淡淡的引物二聚体条带，所以才试着做的定量，定量产物跑胶也是同样的情况，不过阴性对照也有条带，就是不懂为啥阴性对照荧光值反而那么高，还有引物二聚体的问题不知道怎么解决，是不是必须换引物？求大侠指教！
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7楼2012-04-04 20:39:37
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, Good! 2012-04-04 22:26:11
引用回帖:
6楼: Originally posted by 消锦lzhy at 2012-04-04 20:36:42:
非常感谢，其实在这之前用同样的引物优化过PCR反应程序，电泳条带很清晰，而且没有非特异性产物，只是有淡淡的引物二聚体条带，所以才试着做的定量，定量产物跑胶也是同样的情况，不过阴性对照也有条带

阴性有条带的原因可能是引物二聚体，也就是说，引物以自己为模板把自己扩增出来了。所以只要有引物，就会有曲线，无论是什么对照。看你的溶解曲线，不也是有俩峰吗？可能就是二聚体的峰和产物的峰
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8楼2012-04-04 21:01:33
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nakice

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
对于引物二聚体可以适当提高TM值，另外在设计引物时应尽量避免，可以用DNAMAN看一下引物的二聚体形成情况
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奋斗就是生活，人生只有前进
9楼2012-04-06 10:56:34
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消锦lzhy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by nakice at 2012-04-06 10:56:34:
对于引物二聚体可以适当提高TM值，另外在设计引物时应尽量避免，可以用DNAMAN看一下引物的二聚体形成情况

非常感谢
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10楼2012-04-07 11:25:17
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