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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于表达的问题
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)

[求助] 关于表达的问题

各位大虾你们好！我最近做表达，一直没结果，我做的是串联表达，我在原来三个重复串联片段的基础上延长成六个重复，12个重复，结果六个重复的片段诱导条件的优化有目的蛋白表达，而12重复的却一直没有，我用的pET30a（+）载体，6个重复片段加上载体序列表达蛋白是22.2KD，12重复片段加上载体序列表达蛋白大小应该是38.1KD,但是在这个位置我一直做出的结果是未诱导的条带比诱导的还粗，后来我又用个空菌落BL21也做个对照，结果它在那个位置也有条带！这应该如何办啊，是不是就证明表达不出来啊！请各位高手给于小妹指导一下，万分感谢！
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1楼 2012-03-06 21:27:55
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
XUMIN6891(金币+1): 2012-03-07 21:23:24
上图才好帮你分析。
首先，肯定序列完全正确吗？重复序列在克隆时容易出错的。
其次，将六个重复和12个重复的载体，进行一个平行的实验，看看各自的表达情况。
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2楼2012-03-06 21:42:04
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2012-03-06 21:42:04:
上图才好帮你分析。
首先，肯定序列完全正确吗？重复序列在克隆时容易出错的。
其次，将六个重复和12个重复的载体，进行一个平行的实验，看看各自的表达情况。

测序是完全正确的这点可以排除，另外你说的那个将六个重复和12个重复的载体，进行一个平行的实验是啥意思，我不懂呃，指教一下吧！谢了！
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3楼2012-03-06 21:53:57
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panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助! 2012-03-08 08:35:24
平行试验： 就是在完全相同的条件下，对两种不同的质粒进行转化，单克隆培养，诱导表达，SDS-PAGE分析，看看其表达情况是否一致。以便判断是你试验操作的问题，还是质粒的问题。
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4楼2012-03-06 22:07:18
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XUMIN6891

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by panda73 at 2012-03-06 22:07:18:
平行试验： 就是在完全相同的条件下，对两种不同的质粒进行转化，单克隆培养，诱导表达，SDS-PAGE分析，看看其表达情况是否一致。以便判断是你试验操作的问题，还是质粒的问题。

我那个六串联的表达出来的使用保存正确的菌液进行培养然后诱导表达的，今天我把12串联的的质粒进行转化，然后再准备单克隆培养再进行诱导表达，这样做等于没做平行试验，只是单纯的做12串联的，这样也行吧！
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5楼2012-03-07 19:59:48
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