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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pkd46质粒转化
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thestormcong

银虫 (小有名气)

[求助] pkd46质粒转化

各位师兄师姐，我最近要做red基因敲除。现在在做第一步，将pkd46质粒转化入大肠杆菌中。通过化学转化，在AMP平板上长出大量转化子，通过挑单菌落到含有AMP的摇瓶，过夜后也有大量菌体，而将野生株菌接种至AMP摇瓶，则没有菌体生长。表明细菌里应该已经有质粒。但是几次提取质粒，都没有能够提取到，后来得知pkd46是低拷贝质粒，于是在提质粒时加大菌体量，得到一点点条带，几乎没有。不知道是怎么回事。是不是质粒真的就这么点，还是压根就没有转化成功。现在很是郁闷。后来干脆就对质粒用阿拉伯糖诱导，20mM，一个多小时诱导，也没有见条带与对照有差异。现在很是郁闷，麻烦各位师兄师姐提供点经验。。非常感谢!!!
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1楼 2012-02-25 21:53:52
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thestormcong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by susizheng at 2012-02-27 09:54:16:
转进pKD46后涂平板，挑菌落直接做后面的敲除就行了。
不需要提质粒验证，表达red验证什么的。质粒拷贝数低不好提，阿拉伯糖诱导强度也一般，表达量用PAGE也不一定看的出来。

哦，好的。那我看来要直接做下一步试试。谢谢师兄指点啊，不让我在这个问题上困扰太久。以后有问题再请教您！
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3楼2012-02-27 16:36:42
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助！ 2012-02-27 10:25:34
thestormcong(金币+8): ★★★很有帮助 2012-02-27 16:41:00
转进pKD46后涂平板，挑菌落直接做后面的敲除就行了。
不需要提质粒验证，表达red验证什么的。质粒拷贝数低不好提，阿拉伯糖诱导强度也一般，表达量用PAGE也不一定看的出来。
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Thank-you，so-blue.
2楼2012-02-27 09:54:16
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