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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列（抗体测序）
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列（抗体测序）

最近做杂交瘤细胞里PCR出抗体V区序列.
先提RNA，然后用抗体特异的一套引物RT-PCR，目标片段TA克隆，测序。
发现VH的CDR3位置总有终止密码子，请问有人遇到过这个情况吗？

鉴于上提到杂交瘤传代过多、培养过久会“频繁”的出现各种突变，包括插入、点突变、整个序列不对。所以现在问题集中在杂交瘤的亚克隆过程和培养上，不知各位遇到过这种情况没

[ Last edited by gongeleven on 2012-4-20 at 10:56 ]
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1楼 2012-01-16 09:18:00
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回帖置顶 ( 共有1个 )

匿名

用户注销 (正式写手)
gongeleven(金币+5): 不大可能是突变引起的，因为不同杂交瘤（不同靶点的抗体）基因克隆的时候出现过相同的这种序列 2012-02-16 09:29:55
silicare(金币+2, BioEPI+1): 鼓励发帖交流 2012-02-16 12:55:56
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gongeleven
6楼2012-01-18 09:49:17
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
gongeleven(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 谢谢参与 2012-02-16 12:55:11
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2楼2012-01-17 10:01:15
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whui

至尊木虫 (著名写手)
★
gongeleven(金币+1):谢谢参与
有可能。
你试一试用oligoDT反转录，用恒定区做下游引物
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3楼2012-01-17 15:07:40
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by whui at 2012-01-17 15:07:40:
有可能。
你试一试用oligoDT反转录，用恒定区做下游引物

我用的是 Qiagen Onestep RT-PCR kit， 引物用的是 Mouse-Ig primer set(Novagen)。而且终止密码子后面的序列还是抗体特征的序列（基因组污染RNA？）。之前做过几十个了也没出现这个问题。
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4楼2012-01-18 09:21:28
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-17 10:01:15:
倒是没遇到过这样的情况，CDR3区域是抗体抗原结合的重要区域，一般不会这样的。你确定你的抗体分区没有问题吗？是不是阅读框弄错了，翻译后的氨基酸序列你blast了吗？

估计这个根本就不是起作用的抗体基因。
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5楼2012-01-18 09:23:27
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-18 09:49:17:
既然已经是鉴定的单克隆杂交瘤细胞了，那么这个细胞里面的抗体基因该是个功能性抗体基因序列，不应该是截断的抗体基因序列，你可以同时多测几个，以防测序出现问题。
你还可以看看那个终止密码出现的部位通常是 ...

转化后菌落PCR，产物去测序，这样算纯粹的平板涂布培养吗
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7楼2012-02-16 09:32:47
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-18 09:49:17:
既然已经是鉴定的单克隆杂交瘤细胞了，那么这个细胞里面的抗体基因该是个功能性抗体基因序列，不应该是截断的抗体基因序列，你可以同时多测几个，以防测序出现问题。
你还可以看看那个终止密码出现的部位通常是 ...

现在又出新问题，就是突变类型，不止是变成终止密码子，还出现CDR3区插入或缺失碱基导致移码。。。
“抗体基因在大肠杆菌中摇瓶培养很容易突变”，难道是我的T载体不好？
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8楼2012-03-31 11:16:27
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lmxu0917 at 2012-01-18 09:49:17:
既然已经是鉴定的单克隆杂交瘤细胞了，那么这个细胞里面的抗体基因该是个功能性抗体基因序列，不应该是截断的抗体基因序列，你可以同时多测几个，以防测序出现问题。
你还可以看看那个终止密码出现的部位通常是 ...

向你求助，做这个的人貌似不多，请看我原帖补充内容
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9楼2012-04-20 11:00:15
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whui

至尊木虫 (著名写手)
换个菌种，比如XL1-BLUE……
不要用TOP10, DH5a之类常用感受态菌种
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10楼2012-05-12 18:05:10
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llyman

银虫 (小有名气)
★
gongeleven(金币+1): 谢谢参与
请教一下：现有某商业泛素单抗，如何获得该抗体的基因序列？
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11楼2012-06-07 21:10:23
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by llyman at 2012-06-07 21:10:23
请教一下：现有某商业泛素单抗，如何获得该抗体的基因序列？

你这个是商业化的，不是自己全程生产鉴定出来的，比较麻烦了。
你可以看产品说明书，看看有没有提供序列或者相关专利和文献。
最后的办法只有氨基酸测序了
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12楼2012-06-08 11:32:11
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whui

至尊木虫 (著名写手)
★
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-12-02 09:25:57
先确定你的杂交瘤有结合等活性；
然后用oligoDT反转录，下游引物定位在CH1/CK/CL的下游，不要用铰链区或恒定区其实不远处的引物
多挑几个克隆，换一种T载体和宿主菌，或者尝试加糖等抑制表达
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13楼2012-12-02 01:32:17
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ruociwang

铁虫 (初入文坛)
★
gongeleven(金币+1): 谢谢参与
我也遇到了同样的问题，测序发现CDR3区域出现终止密码子，不知楼主最终如何解决的？
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15楼2014-10-29 10:17:41
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by ruociwang at 2014-10-29 10:17:41
我也遇到了同样的问题，测序发现CDR3区域出现终止密码子，不知楼主最终如何解决的？

这种序列肯定是假的，这种情况，可以做5’gene racer，还是不行的话，那就是杂交瘤品质有问题

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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16楼2014-10-29 11:24:46
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ruociwang

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by gongeleven at 2014-10-29 11:24:46
这种序列肯定是假的，这种情况，可以做5’gene racer，还是不行的话，那就是杂交瘤品质有问题

...

我用的方法就是5‘ gene racer, 杂交瘤细胞也打过老鼠，纯化后的抗体条带单一，功能健全。不知道有没有可能在找5’端序列的时候，刚好挑到了不对的序列。你之前CDR3出现终止密码子，是不是又把相应的杂交瘤细胞做了亚克隆，然后再继续做后续的实验啊？
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17楼2014-10-29 12:31:09
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
PCR产物插入t载体，测十几个克隆，看看有没有正确序列；
蛋白水平有没有测过亚型，不知你这个是轻链还是重链，如果是轻链，有没有可能是稀有的lambda轻链

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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18楼2014-10-30 01:19:38
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ruociwang

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by gongeleven at 2014-10-30 01:19:38
PCR产物插入t载体，测十几个克隆，看看有没有正确序列；
蛋白水平有没有测过亚型，不知你这个是轻链还是重链，如果是轻链，有没有可能是稀有的lambda轻链

测过亚型：IgG1, 轻链是k链，也是轻链中出现问题，现在正多送几个克隆碰碰运气呢。。。
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19楼2014-10-30 14:36:11
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紫铃清风li

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by gongeleven at 2014-10-30 01:19:38
PCR产物插入t载体，测十几个克隆，看看有没有正确序列；
蛋白水平有没有测过亚型，不知你这个是轻链还是重链，如果是轻链，有没有可能是稀有的lambda轻链

不知道楼主这个问题解决了没有,目前我也在做相关方向的研究,根据自己扩增的序列以及结合国内外的文献资料报道,如果在CDR3区域出现终止子,可能是假基因.杂交瘤细胞在融合时,是骨髓瘤细胞和脾细胞融合而来,因此杂交瘤细胞基因组中或多或少都会出现骨髓瘤细胞的假基因片断.楼主可能是使用得引物特异性不好,导致扩增出了假基因.
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20楼2015-07-10 11:57:24
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chenyili0601

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，我最近也遇到这个问题，可以交流一下吗
我的联系方式是13916068544
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21楼2016-01-19 10:53:16
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chenyili0601

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by wizardfan at 2012-12-02 09:25:42

楼主，你们后来是怎么解决的
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22楼2016-01-21 12:20:17
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by chenyili0601 at 2016-01-21 12:20:17
楼主，你们后来是怎么解决的...

现在经验丰富了，做不出来基本就是细胞问题

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23楼2016-01-21 23:14:38
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mlbiosci

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主可否共享下相关资料，比如orotocol啥的，对此很有兴趣

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24楼2016-01-22 00:02:13
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丁梦娟1993

银虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
20楼: Originally posted by 紫铃清风li at 2015-07-10 11:57:24
不知道楼主这个问题解决了没有,目前我也在做相关方向的研究,根据自己扩增的序列以及结合国内外的文献资料报道,如果在CDR3区域出现终止子,可能是假基因.杂交瘤细胞在融合时,是骨髓瘤细胞和脾细胞融合而来,因此杂交瘤 ...

你好！不知道你能不能看到，还请问一下如果一直出现假基因应该怎么处理啊？
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25楼2018-06-15 17:19:05
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wizardfan14楼
2012-12-02 09:25   回复  
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