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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列（抗体测序）
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列（抗体测序）

最近做杂交瘤细胞里PCR出抗体V区序列.
先提RNA，然后用抗体特异的一套引物RT-PCR，目标片段TA克隆，测序。
发现VH的CDR3位置总有终止密码子，请问有人遇到过这个情况吗？

鉴于上提到杂交瘤传代过多、培养过久会“频繁”的出现各种突变，包括插入、点突变、整个序列不对。所以现在问题集中在杂交瘤的亚克隆过程和培养上，不知各位遇到过这种情况没

[ Last edited by gongeleven on 2012-4-20 at 10:56 ]
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1楼 2012-01-16 09:18:00
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ruociwang

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
16楼: Originally posted by gongeleven at 2014-10-29 11:24:46
这种序列肯定是假的，这种情况，可以做5’gene racer，还是不行的话，那就是杂交瘤品质有问题

...

我用的方法就是5‘ gene racer, 杂交瘤细胞也打过老鼠，纯化后的抗体条带单一，功能健全。不知道有没有可能在找5’端序列的时候，刚好挑到了不对的序列。你之前CDR3出现终止密码子，是不是又把相应的杂交瘤细胞做了亚克隆，然后再继续做后续的实验啊？
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17楼2014-10-29 12:31:09
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
gongeleven(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 谢谢参与 2012-02-16 12:55:11
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2012-01-17 10:01:15
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whui

至尊木虫 (著名写手)
★
gongeleven(金币+1):谢谢参与
有可能。
你试一试用oligoDT反转录，用恒定区做下游引物
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-01-17 15:07:40
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by whui at 2012-01-17 15:07:40:
有可能。
你试一试用oligoDT反转录，用恒定区做下游引物

我用的是 Qiagen Onestep RT-PCR kit， 引物用的是 Mouse-Ig primer set(Novagen)。而且终止密码子后面的序列还是抗体特征的序列（基因组污染RNA？）。之前做过几十个了也没出现这个问题。
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4楼2012-01-18 09:21:28
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