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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)


[交流] 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列(抗体测序)

最近做杂交瘤细胞里PCR出抗体V区序列.
先提RNA,然后用抗体特异的一套引物RT-PCR,目标片段TA克隆,测序。
发现VH的CDR3位置总有终止密码子,请问有人遇到过这个情况吗?

鉴于上提到杂交瘤传代过多、培养过久会“频繁”的出现各种突变,包括插入、点突变、整个序列不对。所以现在问题集中在杂交瘤的亚克隆过程和培养上,不知各位遇到过这种情况没

[ Last edited by gongeleven on 2012-4-20 at 10:56 ]
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whui

至尊木虫 (著名写手)


换个菌种,比如XL1-BLUE……
不要用TOP10, DH5a之类常用感受态菌种
10楼2012-05-12 18:05:10
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匿名

用户注销 (正式写手)



gongeleven(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 谢谢参与 2012-02-16 12:55:11
本帖仅楼主可见
2楼2012-01-17 10:01:15
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whui

至尊木虫 (著名写手)



gongeleven(金币+1):谢谢参与
有可能。
你试一试用oligoDT反转录,用恒定区做下游引物
3楼2012-01-17 15:07:40
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)


引用回帖:
: Originally posted by whui at 2012-01-17 15:07:40:
有可能。
你试一试用oligoDT反转录,用恒定区做下游引物

我用的是 Qiagen Onestep RT-PCR kit, 引物用的是 Mouse-Ig primer set(Novagen)。而且终止密码子后面的序列还是抗体特征的序列(基因组污染RNA?)。之前做过几十个了也没出现这个问题。
4楼2012-01-18 09:21:28
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