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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列（抗体测序）
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 从 单克隆杂交瘤细胞 到 抗体序列（抗体测序）

最近做杂交瘤细胞里PCR出抗体V区序列.
先提RNA，然后用抗体特异的一套引物RT-PCR，目标片段TA克隆，测序。
发现VH的CDR3位置总有终止密码子，请问有人遇到过这个情况吗？

鉴于上提到杂交瘤传代过多、培养过久会“频繁”的出现各种突变，包括插入、点突变、整个序列不对。所以现在问题集中在杂交瘤的亚克隆过程和培养上，不知各位遇到过这种情况没

[ Last edited by gongeleven on 2012-4-20 at 10:56 ]
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1楼 2012-01-16 09:18:00
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紫铃清风li

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
18楼: Originally posted by gongeleven at 2014-10-30 01:19:38
PCR产物插入t载体，测十几个克隆，看看有没有正确序列；
蛋白水平有没有测过亚型，不知你这个是轻链还是重链，如果是轻链，有没有可能是稀有的lambda轻链

不知道楼主这个问题解决了没有,目前我也在做相关方向的研究,根据自己扩增的序列以及结合国内外的文献资料报道,如果在CDR3区域出现终止子,可能是假基因.杂交瘤细胞在融合时,是骨髓瘤细胞和脾细胞融合而来,因此杂交瘤细胞基因组中或多或少都会出现骨髓瘤细胞的假基因片断.楼主可能是使用得引物特异性不好,导致扩增出了假基因.
赞一下 回复此楼
20楼2015-07-10 11:57:24
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
gongeleven(金币+1):谢谢参与
silicare(金币+1): 谢谢参与 2012-02-16 12:55:11
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2012-01-17 10:01:15
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whui

至尊木虫 (著名写手)
★
gongeleven(金币+1):谢谢参与
有可能。
你试一试用oligoDT反转录，用恒定区做下游引物
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-01-17 15:07:40
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by whui at 2012-01-17 15:07:40:
有可能。
你试一试用oligoDT反转录，用恒定区做下游引物

我用的是 Qiagen Onestep RT-PCR kit， 引物用的是 Mouse-Ig primer set(Novagen)。而且终止密码子后面的序列还是抗体特征的序列（基因组污染RNA？）。之前做过几十个了也没出现这个问题。
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4楼2012-01-18 09:21:28
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