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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助关于基因的半定量
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[求助] 求助关于基因的半定量

有一批基因要做定量。老板不让用taqman或sybr法，他说pcr一下再跑个电泳看看就行了。我很晕啊。他还说内参要和目的基因在用一个管里。我想问：
1.那么两对引物（内参和目的基因）在同一个管子里是否PCR产物片段大小得相差比较大？
2.这属于多重PCR，好不好做？有什么要注意的？
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1楼 2011-12-08 10:13:08
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jeffzm

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

xuehu2008(金币+1): 2011-12-10 02:50:22
弄个混合体系不行啊？只引物不一样
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2楼2011-12-08 10:19:51
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c3024034

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

xuehu2008(金币+2): 2011-12-10 02:50:36
是可以的，内参要和你的目的基因相差大点，而且你的条件要摸索一下，内参退火温度的范围比较大，主要是你的目的基因要摸好条件
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3楼2011-12-08 19:28:57
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

xuehu2008(金币+2): 2011-12-10 02:51:50
引用回帖:
1楼: Originally posted by xuehu2008 at 2011-12-08 10:13:08:
有一批基因要做定量。老板不让用taqman或sybr法，他说pcr一下再跑个电泳看看就行了。我很晕啊。他还说内参要和目的基因在用一个管里。我想问：
1.那么两对引物（内参和目的基因）在同一个管子里是否PCR产物片段大 ...

呵呵 不打算反驳的话就照做吧
引物设计成Tm相同的  注意引物间的二聚体 错误引发 长度拉开些 相差100bp足够了 胶配浓些再短点也行
先按习惯的体系做一次 根据结果优化 退火温度 各对引物的浓度比例 dNTP浓度 Mg离子浓度 PCR促进剂
两对一起不那么难的
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4楼2011-12-08 20:48:09
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218340

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

做的半定量的，要看你两对引物之间会不会形成二聚体，如果可能形成二聚体，那么就不能在一个管内扩增，这就要求你设计好PCR引物，实在不行的话就要分管扩增了。
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5楼2011-12-09 13:18:00
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)
恩，大家说的极有道理。有什么办法能看两对引物之间的二聚体呢？
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6楼2011-12-10 02:52:39
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qingdee

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xuehu2008 at 2011-12-10 02:52:39:
恩，大家说的极有道理。有什么办法能看两对引物之间的二聚体呢？

用DNASTAR软件
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7楼2012-03-06 11:30:03
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