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panda73金虫 (小有名气)
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分子生物学技术目前已经是几乎所有主流实验室的必备技术，而其中基因克隆技术作为分子生物学研究的基础和首要技术，是大部分科研同行接触到的第一种分子生物学技术。但残酷的现实是：很多实验室并未能掌握基因克隆的精髓，这直接导致很多实验室完成一个常规克隆的时间安排是一周，甚至两周。特别是实验室的新人，往往抓不住该技术的关键，浪费了大量的时间在一些在导师看来很简单的工作，影响了课题的进展。下面，我结合我多年的分子生物学研究的经验，对基因克隆的关键点进行简单的总结，希望对大家有点帮助。 首先，大家一定要有量的概念。很多实验室，在进行基因克隆时，对操作的DNA根本就没有量的概念，质粒，PCR产物从不定量，加限制性内切酶时也是参照酶的说明书，直接加1ul酶进行酶切。这样做，运气好时，克隆也能成功，但大多数时候，则需要进行多次所谓的条件优化，才能克隆成功。而事实上，你只要抓住基因克隆技术中几个关键的参数（量），一个常规的克隆工作也就是2-3天，成功率在90%以上。首先一个关键的参数是：在设计连接实验时，所需的酶切处理回收的载体量是50-100ng，而酶切回收后PCR产物的分子数是载体的3-5倍也足够了（PCR的具体质量取决于PCR产物和载体的相对分子大小，大家可以简单换算一下）。据此，可以推算出，进行酶切实验设计时，所需要的质粒载体的用量和PCR产物的用量：一般质粒载体用量在0.5-1.0ug，而PCR产物酶切时用量在0.3-0.5ug（这其中要考虑酶切后的回收效率，一般在30-80%之间，取决于使用的回收方法及试剂盒质量）。这就要求大家在进行基因克隆时，必须有对DNA随时进行定量的习惯（包括质粒和PCR产物，现在，几乎所有的实验室都配备了各种核酸定量仪，定量也很方便）。确定酶切所需的载体DNA和PCR产物的用量后，就需要确定另一个最关键的参数：限制性内切酶的用量。这在很多实验室是一个不受重视的环节，而我认为这是整个基因克隆中最关键的环节，酶切的成功与否直接决定了克隆的成败。在NEB或Takara等限制性内切酶供应商的产品说明中，都会有一个通用酶切体系推荐（基本都是1ugDNA用1ul酶）。如果大家看看各个公司的酶的单位定义（在1个小时内，在合适的温度，完全降解1ug的指定底物（通常是lambda DNA)所需的酶量定位为1个单位），再仔细想想完全酶切的本质，大家不难看出，这个通用酶切体系其实基本没有什么指导意义。首先，不同的酶单位定义所用的底物并不完全相同（NEB就用到了至少5种不同的DNA作为酶活性单位定义的底物，包括lambda DNA, Adenovirus2 DNA, pXba,pBR322等），即使所用的底物相同，不同的酶在相同的底物上的识别位点的个数也不可能都相同，这就直接导致，这些酶用在我们的载体分子（或PCR产物）酶切时，所需的酶量是不相同，而具体的酶用量是完全可以计算出来的。通常PCR产物所需的酶量远远多于等量的质粒载体酶切所需的酶量）。 其次，基因克隆中一定要有设置对照的习惯。如：双酶切时，要设置平行的单酶切对照，以确定这两种酶进行酶切时是否正常（酶的保存不当导致酶失活，酶量使用不当。或DNA质粒不好都会导致酶切不完全或出现酶的星活性star activity等）。连接时，一定要设置空载体自连的对照，以确定载体处理的质量等。 一般来说，决定克隆成败的两个关键点是：1.质粒DNA的质量：可以通过OD260/OD280的比值（1.7-1.9），或电泳的带型（单一的超螺旋条带）进行初步的判断。2.酶切体系的设计：包括DNA的用量，限制性内切酶的用量（计算具体用量），酶切体系的体积（控制甘油的浓度在10%以下）。通常，连接转化环节都不是影响克隆成败的关键因素（除非，实验就做错了）。 希望以上拙见对大家有帮助，有兴趣可以再交流。 [ Last edited by panda73 on 2011-12-4 at 00:17 ] |
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