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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量曲线问题
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量曲线问题

刚开始做荧光定量PCR，用的内参基因是18SrRNA,分别用他们的质粒10倍稀释8管做标准曲线，退火温度62度，第一次跑图目的基因居然是这样的，内参的也是一个变化趋势，到底是引物的问题还是模板的问题，还是其他操作的原因呢？请有经验的虫子指点一下啊。。。
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1楼 2011-11-26 09:16:05
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wangcheng2650

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 个人也是这个看法 2011-11-27 16:22:08
从图上看应该是引物的问题，特异性不强，产生了较多的非特异性扩增及引物二聚体！建议重新设计引物！
PS:你用的哪家公司的实时荧光定量PCR仪呢？
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纳兰欣光
日子是混出来的！
2楼2011-11-27 16:03:43
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高天上圣

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物有问题的可能性最大；如果引物保证没问题，从35个循环以后才出峰来看，说明几乎没模板，这个峰是引物二聚体导致的。
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问鼎九州，逐鹿中原！
3楼2011-11-30 21:25:36
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by wangcheng2650 at 2011-11-27 16:03:43:
从图上看应该是引物的问题，特异性不强，产生了较多的非特异性扩增及引物二聚体！建议重新设计引物！
PS:你用的哪家公司的实时荧光定量PCR仪呢？

伯乐的IQ5，可是如果是引物的问题的话，那不会在二十七八个循环处降落的吧？咨询仪器技术人员可能是光路问题。。。
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4楼2011-12-01 13:53:32
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wangcheng2650

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你那个二十七八个循环那个应该不能算是扩增曲线吧？正常曲线是S形的，你那个是引物二聚体造成的假阳性扩增！
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日子是混出来的！
5楼2011-12-01 14:10:36
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wangcheng2650 at 2011-12-01 14:10:36:
你那个二十七八个循环那个应该不能算是扩增曲线吧？正常曲线是S形的，你那个是引物二聚体造成的假阳性扩增！

将图片发给公司了，伯乐仪器的人说是仪器的原因。。。
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6楼2011-12-02 13:08:24
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