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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RACE克隆 请帮助鉴别
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] RACE克隆 请帮助鉴别

在做完RACE PCR后，发现有条带，（Fig-1 箭头所指），但是纯化后发现是弥散（Fig-2），不知道为何？？请高手指点

这个弥散的条带能连接大肠杆菌测序吗？

Fig-2



Fig-1
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1楼 2011-11-24 00:31:16
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liaojianglin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

模板需要稀释倍数不够
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2楼2011-11-24 10:29:23
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

做个巢式吧,估计不是模版量太大,是基因表达量不高吧
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3楼2011-11-24 11:36:17
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liaojianglin at 2011-11-24 10:29:23:
模板需要稀释倍数不够

能否详细说明
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将有能量帮助他人作为自己的人生追求！
4楼2011-11-24 14:42:48
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zcqcau

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shaquila at 2011-11-24 11:36:17:
做个巢式吧,估计不是模版量太大,是基因表达量不高吧

巢式PCR的话 是不是在第二轮的时候仍然使用 RACE Kit（我们用的是CloneTECH
）说明手册的PCR程序？？？
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将有能量帮助他人作为自己的人生追求！
5楼2011-11-24 14:43:58
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yangym1123

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-11-24 22:02:11
引用回帖:
1楼: Originally posted by zcqcau at 2011-11-24 00:31:16:
在做完RACE PCR后，发现有条带，（Fig-1 箭头所指），但是纯化后发现是弥散（Fig-2），不知道为何？？请高手指点

这个弥散的条带能连接大肠杆菌测序吗？

[color ...

可以试试克隆，不过不保证能出条带，你可以试试巢式或者降落！RACE出现这种结果也很正常，你就用个扩展能力好的酶就行，也没必要用高保真的！
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6楼2011-11-24 17:20:30
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goldenleaf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一定做巢式pcr，其相关原理用google一搜就出来，很简单的！
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7楼2011-11-24 19:07:44
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cellliu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

模板浓度太高，稀释模板
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8楼2012-06-27 20:17:25
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z7531242

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

稀釋個30~50倍然後做巢式PCR應該就可以解決您的問題了!!
protocal:    20 cycles (Poly A+ RNA) OR 25 cycles (Total RNA):
                94°C 30 sec
                68°C 30 sec
                72°C 3 min*
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9楼2013-07-01 16:15:06
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