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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 上下游引物退火温度相差16℃，
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rancase04

木虫 (正式写手)

[求助] 上下游引物退火温度相差16℃，

采用文献上的引物 上下游引物退火温度分别为45.2℃和61.4℃，目的片段为1 k bp
pcr程序设定：
1：94℃ 5分钟→[94℃ 30秒；60℃ 30秒；72℃ 45秒]→5cycles→[94℃ 30秒；55℃ 30秒；72℃ 45秒]→35cycles→72℃ 5分钟
2：梯度pcr     94℃ 5分钟→[94℃ 30秒；40-60℃ 30秒；72℃ 45秒]→30cycles→72℃ 5分钟
两个程序均为看到目的条带，两个引物温度相差16℃，是不是不能p出来啊
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1楼 2011-11-21 20:08:05
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
rancase04(金币+3): 2011-12-26 20:42:53
rancase04: 金币+5 2012-04-10 15:00:32
如果是文献上的 应该没错 我有一次也是 用文献的做 PCR死活P不出来 体系/退火温度什么的改了N次 最后干脆把试剂大换血 都用的新的 就做出来了 建议楼主试试
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4楼2011-11-21 21:25:12
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shuangzi8761

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
rancase04(金币+1): 2011-12-26 20:42:40
rancase04: 金币+3 2012-04-10 15:00:49
试下不就知道了。你P什么片段 大小多少？引物相差的也太大了吧
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2楼2011-11-21 20:39:34
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rancase04

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2011-11-21 20:39:34:
试下不就知道了。你P什么片段 大小多少？引物相差的也太大了吧

已经都试过了 p不出来  所以才开始怀疑的   因为与别的基因有很高的同源性  所以设计的引物就成这个样子了   大小为1000 bp
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3楼2011-11-21 21:05:56
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小鱼尾

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by shuangzi8761 at 2011-11-21 21:25:12
如果是文献上的 应该没错 我有一次也是 用文献的做 PCR死活P不出来 体系/退火温度什么的改了N次 最后干脆把试剂大换血 都用的新的 就做出来了 建议楼主试试

我也是按照文献上来的，可是死活也P不出来，那个真叫人郁闷呢。。。
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5楼2012-09-16 22:56:57
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