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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » cDNA 全长判断
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dorothy

金虫 (小有名气)

[交流] cDNA 全长判断

我用tail  PCR 得到了目的基因，orffinder 也找到了编码区和内含子，接下来RT-PCR 扩增cDNA 验证内含子的位置，可是我怎么判断cDNA 的5‘UTR和3’UTR呢？
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1楼 2011-11-14 21:54:39
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)
★
dorothy(金币+1):谢谢参与
dorothy(金币+1): 2011-11-16 11:31:33
先克隆全长cDNA，然后与基因组DNA序列比较。
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2楼2011-11-15 10:09:09
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★
dorothy(金币+1):谢谢参与
dorothy(金币+1): 2011-11-16 11:31:45
5'RACE和3‘RACE技术确定全长序列
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3楼2011-11-15 10:10:47
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dorothy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-15 10:10:47:
5'RACE和3‘RACE技术确定全长序列

呵呵，关键是用不着RACE啊
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4楼2011-11-16 11:32:54
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dorothy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by exon2002 at 2011-11-15 10:09:09:
先克隆全长cDNA，然后与基因组DNA序列比较。

这样只能得到内含子，怎么得到5‘UTR？
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5楼2011-11-16 11:35:17
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-11-17 00:13:25
引用回帖:
4楼: Originally posted by dorothy at 2011-11-16 11:32:54:
呵呵，关键是用不着RACE啊

楼主确定UTR不用RACE吗？
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6楼2011-11-16 12:56:35
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dorothy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-16 12:56:35:
楼主确定UTR不用RACE吗？

请教：我已经得到了DNA序列，包括编码序列和起上下游序列，设计引物直接扩增cDNA, 还需要RACE吗
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7楼2011-11-16 21:25:07
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
dorothy(金币+1):谢谢参与
wanhscn(金币+2): 鼓励交流! 2011-11-17 00:14:02
wanhscn: 楼主可能是在问什么是5‘UTR和3’UTR区？ 2011-11-22 10:55:44
引用回帖:
7楼: Originally posted by dorothy at 2011-11-16 21:25:07:
请教：我已经得到了DNA序列，包括编码序列和起上下游序列，设计引物直接扩增cDNA, 还需要RACE吗

你想要得到UTR,你不用RACE又用什么呢??因为你只知道起始编码区域,他们之外的UTR好象就只能通过RACE来解决吧.
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8楼2011-11-16 22:41:03
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by dorothy at 2011-11-16 13:35:17:
这样只能得到内含子，怎么得到5‘UTR？

只有得到全长（这个大概比你想得要更具包括性），确定起始点及ORF，从而找到起始点之前的引导序列和5‘UTR，以及3’UTR。所以RACE技术是得到全长cDNA最简捷的方法。纠正：RACE扩增得不到内含子！（想一想为什么？）
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9楼2011-11-18 07:34:48
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dorothy

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by exon2002 at 2011-11-18 07:34:48:
只有得到全长（这个大概比你想得要更具包括性），确定起始点及ORF，从而找到起始点之前的引导序列和5‘UTR，以及3’UTR。所以RACE技术是得到全长cDNA最简捷的方法。纠正：RACE扩增得不到内含子！（想一想为什么？）

呵呵，谢谢。我的前提是已经得到了DNA序列，包括编码区上下游各2kb 的序列，预测到了起始点和ORF，有的文献会写5‘UTR和3’UTR各多少个bp,我只是奇怪如何判断5‘UTR和3’UTR？，
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10楼2011-11-18 07:56:53
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
★
dorothy(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
6楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-16 12:56:35:
楼主确定UTR不用RACE吗？

想问一下，做了RACE后，怎样设计引物扩增ORF开放阅读框呢？
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11楼2011-11-21 13:26:41
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 纳兰欣光 at 2011-11-21 13:26:41:
想问一下，做了RACE后，怎样设计引物扩增ORF开放阅读框呢？

根据得到的序列，从ATG开始到终止密码子直接设计引物扩增ORF，如果要连载体的话直接加上酶切位点。
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12楼2011-11-21 18:58:03
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纳兰欣光

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-21 18:58:03:
根据得到的序列，从ATG开始到终止密码子直接设计引物扩增ORF，如果要连载体的话直接加上酶切位点。

谢谢啦！不过还是不很明白啊，那上游引物就是从ATG开始数20几个碱基吗？下游引物就是从TAG开始往前数20几个碱基吗？还有我用的反转录酶是TAKARA的M-MLV，论坛中有的说，这个酶可能不能把mRNA反转到头，可能导致约2000bp的全长验证PCR不出来。。。
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13楼2011-11-22 09:40:39
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justdilo

木虫 (著名写手)
★
dorothy(金币+1):谢谢参与
学习中
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14楼2012-03-06 17:01:47
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swjscx

铜虫 (小有名气)
★
dorothy(金币+1):谢谢参与
我是来看别人回答的
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15楼2012-03-07 10:31:37
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