| 查看: 2828 | 回复: 11 | ||
| 本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看 | ||
[求助]
关于Q-PCR的一些疑问
|
||
|
最近在做Q-pcr，要扩增一个表达量很底的mRNA 设计了引物上机去做，溶解曲线不单一有两个峰，一个大一点一个小一点，大一点的应该是产物，但两峰高度差距不算太大，距离倒是蛮远的 扩增曲线测定的Ct值在32左右，由于样品的原因，提取的RNA可能不是很纯，RNA浓度也不好提高了 改变过退火温度，变化不大 换过很多引物，由于这个mRNA丰度太低，很多的引物都扩不出来 仪器自动分析的CT值在复孔之间差距0.5以内 想问一下，我这个数据可以用么，如果不行要怎样提高扩增的特异性或者怎样改变一下？ |
回复此楼» 猜你喜欢
朋友圈看到的
已经有9人回复
-
能否退出参与的面上项目解除限项
已经有13人回复
-
让我中一个面上吧！
已经有16人回复
-
放榜前的不淡定
已经有17人回复
-
科研孤儿太难了
已经有19人回复
-
明天应该可查了！？
已经有4人回复
-
什么时候开奖？
已经有11人回复
-
范进中举一文的中心思想
已经有6人回复
-
建议基金发布提前给出明确的时间点
已经有14人回复
-
2026国自然函评费到账
已经有17人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 回答一些关于Multiwfn的疑问以及未来Multiwfn的发展打算
已经有37人回复
- 帮我看看这个溶解qPCR曲线
已经有6人回复
- 不解的问题，q-PCR结果分析。
已经有6人回复
- 关于格式反应的一些疑问
已经有15人回复
- 关于基金的一些疑问
已经有5人回复
- HELP!! q-PCR Stepone (Derivative Reporter)
已经有7人回复
- 关于细菌RT-PCR的一些问题，希望同行探讨一下
已经有4人回复
- 关于清华博士的一些疑问
已经有27人回复
- 【求助/交流】qPCR问题求助，请大家帮帮忙，谢谢
已经有5人回复
- 【求助】关于自旋多重度（基态vs激发态）的一些疑问
已经有9人回复
- 【交流】关于纯水机的一些疑问
已经有10人回复
terry130
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 4
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 2283.9
- 散金: 19
- 红花: 9
- 帖子: 388
- 在线: 39.3小时
- 虫号: 313316
- 注册: 2007-02-24
- 性别: GG
- 专业: 细胞死亡
2楼2011-11-15 08:08:30
3楼2011-11-15 16:35:41
terry130
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 4
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 2283.9
- 散金: 19
- 红花: 9
- 帖子: 388
- 在线: 39.3小时
- 虫号: 313316
- 注册: 2007-02-24
- 性别: GG
- 专业: 细胞死亡
4楼2011-11-15 18:47:58
5楼2011-11-15 21:29:55
terry130
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 4
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 2283.9
- 散金: 19
- 红花: 9
- 帖子: 388
- 在线: 39.3小时
- 虫号: 313316
- 注册: 2007-02-24
- 性别: GG
- 专业: 细胞死亡
6楼2011-11-16 08:49:50
7楼2011-11-16 16:38:30
apple6299
铁杆木虫 (正式写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 14809.7
- 散金: 10
- 红花: 1
- 帖子: 800
- 在线: 715.9小时
- 虫号: 675798
- 注册: 2008-12-16
- 专业: 食品科学基础
【答案】应助回帖
★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
|
做Q-PCR数据好坏与否，首先是引物的设计合不合理，最好是找序列的保守区域进行扩增较好，如果自己设计不好，可以请教别人，如果是TaqMan探针的设计，目前是有公司帮设计的，价格贵蛮多的，看自己实验室的情况了。其次还得保证模板RNA的纯度，花多点时间在这，后面的实验就会比较顺利。实验条件的摸索也比较重要，如果样品多的话，最好做个标准曲线。SYBR Green法的影响因素较多，但是溶解曲线Tm值有两个峰的数据肯定是不可以用的（这和引物的关系比较大，足以说明你的引物肯定不是很好，换引物试试吧），听你描述的情况，离得蛮远，高度差距不算太大，跑跑电泳看下，是不是引物二聚体，或者扩增了什么其他的东西。最后建议，SYBR Green法进行QPCR后，还是要跑下电泳比较好（反正也不花很多的时间，做块胶，上个样，就可以去干自己的事情了）。Ct值在32左右，如果对应的Tm值在80-90摄氏度范围内（miRAN的扩增得看试剂盒的要求，好像是70-80摄氏度），且峰是尖锐单一的，这个值还是可以用的。好的数据是确保Ct值在25-30，这也就是为啥要做标准曲线的原因。 我做了两年多的QPCR（SYBR以及TaqMan的都做过），这只是我小小的一点建议哈。仅供参考 |
8楼2011-11-16 17:13:10
terry130
木虫 (正式写手)
- BioEPI: 4
- 应助: 0 (幼儿园)
- 贵宾: 0.001
- 金币: 2283.9
- 散金: 19
- 红花: 9
- 帖子: 388
- 在线: 39.3小时
- 虫号: 313316
- 注册: 2007-02-24
- 性别: GG
- 专业: 细胞死亡
9楼2011-11-16 21:34:04
10楼2011-11-16 22:15:44
20