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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于Q-PCR的一些疑问
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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tco_001

新虫 (小有名气)

[求助] 关于Q-PCR的一些疑问

最近在做Q-pcr，要扩增一个表达量很底的mRNA
设计了引物上机去做，溶解曲线不单一有两个峰，一个大一点一个小一点，大一点的应该是产物，但两峰高度差距不算太大，距离倒是蛮远的
扩增曲线测定的Ct值在32左右，由于样品的原因，提取的RNA可能不是很纯，RNA浓度也不好提高了
改变过退火温度，变化不大
换过很多引物，由于这个mRNA丰度太低，很多的引物都扩不出来
仪器自动分析的CT值在复孔之间差距0.5以内
想问一下，我这个数据可以用么，如果不行要怎样提高扩增的特异性或者怎样改变一下？
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1楼 2011-11-14 21:25:42
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-15 17:53:01
tco_001(金币+10): 2011-11-16 16:38:38
应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物，知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息？如果有的话应该不难找到一对专一的引物。
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摒气动方息，宁神心自明。
2楼2011-11-15 08:08:30
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tco_001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-15 08:08:30:
应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物，知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息？如果有的话应该不难找到一对专一的引物。

那是不是只要我的溶解曲线的峰时单一的就可以认为我的数据是可用的呢？
不知道在哪里看到说ct值超过30得出的结果就不是很可行了，毕竟qpcr的影响因素太多了
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3楼2011-11-15 16:35:41
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-15 16:35:41:
那是不是只要我的溶解曲线的峰时单一的就可以认为我的数据是可用的呢？
不知道在哪里看到说ct值超过30得出的结果就不是很可行了，毕竟qpcr的影响因素太多了

你要理解溶解曲线的含义啊。 他是cycle-signal曲线的导数曲线。一个标准的cycle-signal所对应的溶解曲线就应该是单峰的。这个只是数据可用的必要条件。并不是充分条件。如果你的非特异扩增曲线跟你的特异扩增曲线很相近的话，那么他们的溶解曲线仍然是单峰，但这种情况下的数据也是不可用的。这也是taqman探针法的优势所在了。~
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4楼2011-11-15 18:47:58
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tco_001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-15 18:47:58:
你要理解溶解曲线的含义啊。 他是cycle-signal曲线的导数曲线。一个标准的cycle-signal所对应的溶解曲线就应该是单峰的。这个只是数据可用的必要条件。并不是充分条件。如果你的非特异扩增曲线跟你的特异扩增曲线 ...

恩，现在我用的是SYBR green，那我如何检查我扩增出来的产物是正确的而不是假阳性的结果呢？琼脂糖电泳试过了，效果不是很好，做northern？还是不用检测？
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5楼2011-11-15 21:29:55
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-15 21:29:55:
恩，现在我用的是SYBR green，那我如何检查我扩增出来的产物是正确的而不是假阳性的结果呢？琼脂糖电泳试过了，效果不是很好，做northern？还是不用检测？

你做real time PCR摸条件的时候都不跑电泳的吗？？  在确定条件之后要跑一下电泳哦。这是最基本的验证了，必须是背景低，无拖带，条带单一才行。 这个是sybr green法的要求~
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摒气动方息，宁神心自明。
6楼2011-11-16 08:49:50
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tco_001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-16 08:49:50:
你做real time PCR摸条件的时候都不跑电泳的吗？？  在确定条件之后要跑一下电泳哦。这是最基本的验证了，必须是背景低，无拖带，条带单一才行。 这个是sybr green法的要求~

好吧，主要是没人带就自己在那摸索着做，以前也用电泳摸过的，但是觉得reaLtime的条件和普通pcr的条件不是很一样，照搬的话效果不是很好，但是一调整又觉得不确定了，很矛盾的
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7楼2011-11-16 16:38:30
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apple6299

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
引用回帖:
1楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-14 21:25:42:
最近在做Q-pcr，要扩增一个表达量很底的mRNA
设计了引物上机去做，溶解曲线不单一有两个峰，一个大一点一个小一点，大一点的应该是产物，但两峰高度差距不算太大，距离倒是蛮远的
扩增曲线测定的Ct值在32左右， ...

做Q-PCR数据好坏与否，首先是引物的设计合不合理，最好是找序列的保守区域进行扩增较好，如果自己设计不好，可以请教别人，如果是TaqMan探针的设计，目前是有公司帮设计的，价格贵蛮多的，看自己实验室的情况了。其次还得保证模板RNA的纯度，花多点时间在这，后面的实验就会比较顺利。实验条件的摸索也比较重要，如果样品多的话，最好做个标准曲线。SYBR Green法的影响因素较多，但是溶解曲线Tm值有两个峰的数据肯定是不可以用的（这和引物的关系比较大，足以说明你的引物肯定不是很好，换引物试试吧），听你描述的情况，离得蛮远，高度差距不算太大，跑跑电泳看下，是不是引物二聚体，或者扩增了什么其他的东西。最后建议，SYBR Green法进行QPCR后，还是要跑下电泳比较好（反正也不花很多的时间，做块胶，上个样，就可以去干自己的事情了）。Ct值在32左右，如果对应的Tm值在80-90摄氏度范围内（miRAN的扩增得看试剂盒的要求，好像是70-80摄氏度），且峰是尖锐单一的，这个值还是可以用的。好的数据是确保Ct值在25-30，这也就是为啥要做标准曲线的原因。
   我做了两年多的QPCR（SYBR以及TaqMan的都做过），这只是我小小的一点建议哈。仅供参考
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8楼2011-11-16 17:13:10
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terry130

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-16 16:38:30:
好吧，主要是没人带就自己在那摸索着做，以前也用电泳摸过的，但是觉得reaLtime的条件和普通pcr的条件不是很一样，照搬的话效果不是很好，但是一调整又觉得不确定了，很矛盾的

不是让你用两台机器啊，是用同一台机器做。只要是同一台机器，条件就是通用的
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摒气动方息，宁神心自明。
9楼2011-11-16 21:34:04
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tco_001

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by apple6299 at 2011-11-16 17:13:10:
做Q-PCR数据好坏与否，首先是引物的设计合不合理，最好是找序列的保守区域进行扩增较好，如果自己设计不好，可以请教别人，如果是TaqMan探针的设计，目前是有公司帮设计的，价格贵蛮多的，看自己实验室的情况了。 ...

谢谢你啊，主要我现在要做的是一个基因的亚型，这个基因转录后的pro-mRNA要经过剪切过程形成7种mRNA亚型，每种之间区别就100bp左右，我其他的几个都做得差不多了，就是有一个亚型死活做不好，这个亚型的引物我是直接用的人家文献上面的，条件也是一样的，但是做出来就是上面的结果。我的RNA确实不是很好，因为提取RNA的时候就做的不是很好，那我现在应该怎么办呢？我都换了3-4种引物了，每对引物blast的时候都可以，但就是做的时候感觉不好，怨念
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10楼2011-11-16 22:15:44
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