24小时热门版块排行榜    

查看: 2829  |  回复: 11
本帖产生 2 个 BioEPI ,点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

tco_001

新虫 (小有名气)

[求助] 关于Q-PCR的一些疑问

最近在做Q-pcr,要扩增一个表达量很底的mRNA
设计了引物上机去做,溶解曲线不单一有两个峰,一个大一点一个小一点,大一点的应该是产物,但两峰高度差距不算太大,距离倒是蛮远的
扩增曲线测定的Ct值在32左右,由于样品的原因,提取的RNA可能不是很纯,RNA浓度也不好提高了
改变过退火温度,变化不大
换过很多引物,由于这个mRNA丰度太低,很多的引物都扩不出来
仪器自动分析的CT值在复孔之间差距0.5以内
想问一下,我这个数据可以用么,如果不行要怎样提高扩增的特异性或者怎样改变一下?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tco_001

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-15 08:08:30:
应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物,知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息?如果有的话应该不难找到一对专一的引物。

那是不是只要我的溶解曲线的峰时单一的就可以认为我的数据是可用的呢?
不知道在哪里看到说ct值超过30得出的结果就不是很可行了,毕竟qpcr的影响因素太多了
3楼2011-11-15 16:35:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-15 17:53:01
tco_001(金币+10): 2011-11-16 16:38:38
应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物,知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息?如果有的话应该不难找到一对专一的引物。
摒气动方息,宁神心自明。
2楼2011-11-15 08:08:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-15 16:35:41:
那是不是只要我的溶解曲线的峰时单一的就可以认为我的数据是可用的呢?
不知道在哪里看到说ct值超过30得出的结果就不是很可行了,毕竟qpcr的影响因素太多了

你要理解溶解曲线的含义啊。 他是cycle-signal曲线的导数曲线。一个标准的cycle-signal所对应的溶解曲线就应该是单峰的。这个只是数据可用的必要条件。并不是充分条件。如果你的非特异扩增曲线跟你的特异扩增曲线很相近的话,那么他们的溶解曲线仍然是单峰,但这种情况下的数据也是不可用的。这也是taqman探针法的优势所在了。~
摒气动方息,宁神心自明。
4楼2011-11-15 18:47:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tco_001

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by terry130 at 2011-11-15 18:47:58:
你要理解溶解曲线的含义啊。 他是cycle-signal曲线的导数曲线。一个标准的cycle-signal所对应的溶解曲线就应该是单峰的。这个只是数据可用的必要条件。并不是充分条件。如果你的非特异扩增曲线跟你的特异扩增曲线 ...

恩,现在我用的是SYBR green,那我如何检查我扩增出来的产物是正确的而不是假阳性的结果呢?琼脂糖电泳试过了,效果不是很好,做northern?还是不用检测?
5楼2011-11-15 21:29:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 朋友圈看到的 +7 wangzilk 2026-08-18 9/450 2026-08-24 10:50 by cmrandy
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +11 koalala 2026-08-24 13/650 2026-08-24 10:49 by anjeeshine
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +5 炎黄贵胄 2026-08-22 6/300 2026-08-24 06:34 by sincosx
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +11 kulium 2026-08-21 14/700 2026-08-24 02:12 by 流流伤
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +16 羊腰板 2026-08-21 17/850 2026-08-23 23:02 by tianxiaochun
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办? +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 今天放榜吗? +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode,4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 今天基金会出结果吗?20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 看来今天不会放榜了? +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 估计是周四 +3 archvillain 2026-08-18 3/150 2026-08-21 01:48 by jnhyjjm
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
请填处理意见