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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-15 17:53:01
tco_001(金币+10): 2011-11-16 16:38:38
应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物,知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息?如果有的话应该不难找到一对专一的引物。
摒气动方息,宁神心自明。
2楼2011-11-15 08:08:30
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

apple6299

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29
引用回帖:
1楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-14 21:25:42:
最近在做Q-pcr,要扩增一个表达量很底的mRNA
设计了引物上机去做,溶解曲线不单一有两个峰,一个大一点一个小一点,大一点的应该是产物,但两峰高度差距不算太大,距离倒是蛮远的
扩增曲线测定的Ct值在32左右, ...

做Q-PCR数据好坏与否,首先是引物的设计合不合理,最好是找序列的保守区域进行扩增较好,如果自己设计不好,可以请教别人,如果是TaqMan探针的设计,目前是有公司帮设计的,价格贵蛮多的,看自己实验室的情况了。其次还得保证模板RNA的纯度,花多点时间在这,后面的实验就会比较顺利。实验条件的摸索也比较重要,如果样品多的话,最好做个标准曲线。SYBR Green法的影响因素较多,但是溶解曲线Tm值有两个峰的数据肯定是不可以用的(这和引物的关系比较大,足以说明你的引物肯定不是很好,换引物试试吧),听你描述的情况,离得蛮远,高度差距不算太大,跑跑电泳看下,是不是引物二聚体,或者扩增了什么其他的东西。最后建议,SYBR Green法进行QPCR后,还是要跑下电泳比较好(反正也不花很多的时间,做块胶,上个样,就可以去干自己的事情了)。Ct值在32左右,如果对应的Tm值在80-90摄氏度范围内(miRAN的扩增得看试剂盒的要求,好像是70-80摄氏度),且峰是尖锐单一的,这个值还是可以用的。好的数据是确保Ct值在25-30,这也就是为啥要做标准曲线的原因。
   我做了两年多的QPCR(SYBR以及TaqMan的都做过),这只是我小小的一点建议哈。仅供参考
8楼2011-11-16 17:13:10
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