24小时热门版块排行榜

返回列表

本帖产生 2 个 BioEPI ，点击这里进行查看

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

terry130

木虫 (正式写手)

BioEPI: 4
应助: 0 (幼儿园)
贵宾: 0.001
金币: 2283.9
散金: 19
红花: 9
帖子: 388
在线: 39.3小时
虫号: 313316
注册: 2007-02-24
性别: GG
专业: 细胞死亡

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-15 17:53:01
tco_001(金币+10): 2011-11-16 16:38:38

应该是有第二扩增造成的溶解曲线分离。这样的数据不能用的。你必须得换引物，知道找到合适的位置。。你做的基因组有没有全序列信息？如果有的话应该不难找到一对专一的引物。

赞一下(1人)

回复此楼

摒气动方息，宁神心自明。

2楼2011-11-15 08:08:30

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~

回答一些关于Multiwfn的疑问以及未来Multiwfn的发展打算已经有37人回复
帮我看看这个溶解qPCR曲线已经有6人回复
不解的问题，q-PCR结果分析。已经有6人回复
关于格式反应的一些疑问已经有15人回复
关于基金的一些疑问已经有5人回复
HELP!! q-PCR Stepone (Derivative Reporter) 已经有7人回复
关于细菌RT-PCR的一些问题，希望同行探讨一下已经有4人回复
关于清华博士的一些疑问已经有27人回复
【求助/交流】qPCR问题求助，请大家帮帮忙，谢谢已经有5人回复
【求助】关于自旋多重度（基态vs激发态）的一些疑问已经有9人回复
【交流】关于纯水机的一些疑问已经有10人回复

点击这里搜索更多相关资源

科研从小木虫开始，人人为我，我为人人

apple6299

铁杆木虫 (正式写手)

BioEPI: 1
应助: 1 (幼儿园)
金币: 14446.2
散金: 10
红花: 1
帖子: 800
在线: 715.2小时
虫号: 675798
注册: 2008-12-16
专业: 食品科学基础

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, BioEPI+1): 2011-11-17 12:27:29

引用回帖:

1楼: Originally posted by tco_001 at 2011-11-14 21:25:42:
最近在做Q-pcr，要扩增一个表达量很底的mRNA
设计了引物上机去做，溶解曲线不单一有两个峰，一个大一点一个小一点，大一点的应该是产物，但两峰高度差距不算太大，距离倒是蛮远的
扩增曲线测定的Ct值在32左右， ...

做Q-PCR数据好坏与否，首先是引物的设计合不合理，最好是找序列的保守区域进行扩增较好，如果自己设计不好，可以请教别人，如果是TaqMan探针的设计，目前是有公司帮设计的，价格贵蛮多的，看自己实验室的情况了。其次还得保证模板RNA的纯度，花多点时间在这，后面的实验就会比较顺利。实验条件的摸索也比较重要，如果样品多的话，最好做个标准曲线。SYBR Green法的影响因素较多，但是溶解曲线Tm值有两个峰的数据肯定是不可以用的（这和引物的关系比较大，足以说明你的引物肯定不是很好，换引物试试吧），听你描述的情况，离得蛮远，高度差距不算太大，跑跑电泳看下，是不是引物二聚体，或者扩增了什么其他的东西。最后建议，SYBR Green法进行QPCR后，还是要跑下电泳比较好（反正也不花很多的时间，做块胶，上个样，就可以去干自己的事情了）。Ct值在32左右，如果对应的Tm值在80-90摄氏度范围内（miRAN的扩增得看试剂盒的要求，好像是70-80摄氏度），且峰是尖锐单一的，这个值还是可以用的。好的数据是确保Ct值在25-30，这也就是为啥要做标准曲线的原因。
我做了两年多的QPCR（SYBR以及TaqMan的都做过），这只是我小小的一点建议哈。仅供参考

赞一下(1人)

回复此楼

8楼2011-11-16 17:13:10

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

相关版块跳转我要订阅楼主 tco_001 的主题更新

返回列表