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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教一下载体连接的问题
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shenxing325

铜虫 (小有名气)

[求助] 请教一下载体连接的问题

有用过Takara的DNA连接试剂盒的人请指教一下，我用酶切后回收的载体和目的片段可不可以直接用这个试剂盒进行连接，是否还需要对载体进行去磷酸化，如果需要的话该如何操作？（我之前做连接都没有用过去磷酸化，连接效率就比较低，但是都会有成功的几个单克隆，现在想提高一下连接效率）
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1楼 2011-11-04 09:22:16
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-11-05 17:07:21
shenxing325(金币+2): 谢谢，刚好回答了我的问题！ 2011-11-06 16:30:02
要是单酶切就去下磷酸化，TAKARA的去磷酸化酶，操作很简单，37℃30min，失活下溶液回收就可以了，要是双酶切就不用去磷酸化。连接16℃过夜，效果都挺好的。可以换个连接酶试试，东洋纺的高效连接酶，NEB的T4连接酶效率都很高的
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
5楼2011-11-05 14:09:19
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shenxing325

铜虫 (小有名气)
米有人。。。自己顶一下
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2楼2011-11-05 09:16:51
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paulajjh

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

我做链接都没有去磷酸化过程，主要还是操作该温和时需要温和，感受态效率要高。
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3楼2011-11-05 10:22:51
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

如果载体是单酶切处理最好做一下去磷酸化，双酶切的话不需要。好多公司都有去磷酸化的试剂盒，按说明书做就行了
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-11-05 11:58:28
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