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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » BamHI和XhoI双酶切后的片段需要纯化后再用于连接吗？
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yicao917

木虫 (小有名气)

[交流] BamHI和XhoI双酶切后的片段需要纯化后再用于连接吗？

BamHI和XhoI双酶切后的片段需要纯化后再用于连接吗？若是这么做的话T4连接酶的用量是否应该增大，体系中含有1U的T4连接酶、0.05U的BamHI和0.1U的XhoI，4度过夜连接合适吗？
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1楼 2011-10-06 19:29:16
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红多多

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
yicao917(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+3): 很好 2011-10-07 01:08:19
要纯化的，不然反应体系里面有限制性内切酶，做连接的时候连不上去，连接的时候需要保证载体和插入片段的量。另外你用的BamHI和XhoI两种酶的Buffer是不一样的，这样双酶切的效果会很不好的。建议换酶切位点。T4连接酶的连接能力很好的，只要质粒和插入片段没问题，T4的量不用特别增加。
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2楼2011-10-06 19:37:27
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asznpb

木虫 (正式写手)
★ ★
yicao917(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+1): good 2011-10-07 01:08:29
双酶切的时候最好还是同一种buffer，Fermentas Takara的酶一般同样的buffer盖子颜色都是一样的。胶回收纯化一次，完了按照T4的一般量加就是了

[ Last edited by asznpb on 2011-10-6 at 23:36 ]
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2011-10-06 23:35:23
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