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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)

[交流] western blot 请教

现在要做PLK1蛋白，为66KD，立春红染膜后能看到条带，但是发光的时候是白板，这是为什么！
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蛋白质生物学实验经验

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1楼 2011-09-28 17:32:36
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

废哥117

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
wizardfan: 金币+2, 谢谢分享经验 2012-09-03 04:00:02
引用回帖:
4671885楼: Originally posted by yeli1981 at 2012-09-01 17:23:10
楼主麻烦向你咨询一下 你用的是什么品牌的PLK1一抗 我买的santa plk1 不出条带

貌似好多人都说santa的抗体不出条带啊，我的也是，换了家公司的抗体，条带就出来了，不过我们的是多抗，效果还是不好啊
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9楼2012-09-02 10:43:44
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lubuddy

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
睡着数绵羊(金币+1): 非常感谢！ 2011-09-29 10:38:33
adslye(金币+2): 鼓励交流~ 2011-09-29 13:33:19
你是纯化的蛋白么，怎么肯定66kd处就是你的目的蛋白呢？

一抗、二抗都没问题吧？做实验出错的时候需要足够多的阳性和阴性对照才好说明问题吧。你增加对照确保一抗和二抗都完好试试看。
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2楼2011-09-28 20:25:58
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
抗体是能说明问题的     还是不要用丽春红吧
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3楼2011-09-29 08:26:06
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lubuddy at 2011-09-28 20:25:58:
你是纯化的蛋白么，怎么肯定66kd处就是你的目的蛋白呢？

一抗、二抗都没问题吧？做实验出错的时候需要足够多的阳性和阴性对照才好说明问题吧。你增加对照确保一抗和二抗都完好试试看。

我做的是PLK1蛋白，不是纯化的，大小为66KD。在加个确保会出的样品看看。
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4楼2011-09-29 10:38:08
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睡着数绵羊

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by linyingjia at 2011-09-29 08:26:06:
抗体是能说明问题的     还是不要用丽春红吧

为什么不能用丽春红那？
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5楼2011-09-29 10:39:05
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weigb503

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
adslye(金币+3): 恩，好建议。任何时候对照试验都是非常有价值的。 2011-09-29 13:33:57
睡着数绵羊(金币+1): 嗯，是哦，谢谢！ 2011-09-30 10:10:24
染色只能说明你的目的蛋白已成功转到膜上了，但是WB后面还需要封闭，一抗，二抗，所以有可能是你后面出问题了，建议楼主做WB时候一定要选择好的阳线质控，确保以后的试验没有问题。
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6楼2011-09-29 10:46:55
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linyingjia

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
睡着数绵羊(金币+1): 谢谢！ 2011-09-30 10:10:08
引用回帖:
5楼: Originally posted by 睡着数绵羊 at 2011-09-29 10:39:05:
为什么不能用丽春红那？

没有特异性吧     还是单抗适用
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7楼2011-09-29 13:54:32
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yeli1981

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主麻烦向你咨询一下 你用的是什么品牌的PLK1一抗 我买的santa plk1 不出条带
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8楼2012-09-01 17:23:10
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yeli1981

银虫 (小有名气)
лл ?
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10楼2012-09-02 12:31:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
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11楼2014-07-12 00:29:07
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