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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于酶切验证克隆的一点点小疑问！
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天使托

专家顾问 (职业作家)

[交流] 关于酶切验证克隆的一点点小疑问！

最近做克隆实在不顺利啊。。。。蓝白斑筛选，第一次挑了近20个白的，验证全部不对。。。悲剧。。。

于是重复第二次，依然挑了10+白斑，继续test，可是依然悲剧。。。
  无奈想碰运气，从涂布的板子上重新挑了几个划线，次日验证，于是有一个PCR扩增了出来，于是乎提质粒，酶切验证，就在酶切这一步出问题了。。。。
上图，大家看看，给点建议，为什么酶切出来的载体和基因和原来的不大一样，有一点点偏大。。。
1:酶切的载体；2：酶切的基因；3：酶切的重组载体1号；4：酶切的重组载体2号
注：1号和2号为同一载体，从同一菌中提取出来！
左→右：1 2 3 4


哪位能给我解释一下为什么三号酶切的和原来基因载体酶切的大小不太一样，而是有些偏大，而4号却无任何差别，我早上酶切了一次，发现这样的问题，于是下午重复了一次，可依然如此。。。不知道原因为何？
这样的酶切结果能够说明成功进行克隆了吗？
求教！谢谢！
昨天晚上我想了想，还是得再重新进行酶切看看，虽然科研这个东西不能太过于较真，但是有时候还是严谨一点的好。。。我今天重新提取了质粒，然后酶切，双酶切一个，然后单酶切一下。。。应该很容易就能看出来是否克隆上了。。。等会直接上图！

[ Last edited by 天使托 on 2011-9-23 at 14:51 ]
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quiller2000

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1楼 2011-09-22 16:25:40
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susizheng

木虫 (著名写手)
★
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应该没什么问题吧，不放心，测序之。
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2楼2011-09-22 16:47:30
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-23 12:35:37
测序吧，木有问题的！走胶的原因。如果真的有故事，那是很小很小的概率，呵呵
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3楼2011-09-22 23:59:47
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小鸟剑客

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-23 12:35:44
你到胶太厚了，到得薄点看看，也许清楚点，建议直接测序吧
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4楼2011-09-23 08:28:14
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friya0910

新虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
1楼: Originally posted by 天使托 at 2011-09-22 16:25:40:
最近做克隆实在不顺利啊。。。。蓝白斑筛选，第一次挑了近20个白的，验证全部不对。。。悲剧。。。

于是重复第二次，依然挑了10+白斑，继续test，可是依然悲剧。。。
  无奈想碰运气，从涂布的板子上重新挑了 ...

楼主的酶切做的很好了，我做一个双酶切验证（6000bp载体+300bp目的基因），怎么做都出不来一张很漂亮的图，双酶切后载体特别亮，目的基因只有模糊的影子！也不知道这样的图能不能用，要是能切到像楼主那样的图我就开心死了！
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5楼2011-09-23 11:52:34
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joyjane88

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-09-30 07:45:32
为什么假阳性那么多？抗生素失效了吗？
没切的结果看着是没什么问题的，测序吧。
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6楼2011-09-29 22:47:48
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