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[求助]
进行羟胺裂解后，进行蛋白的二次过亲和层析住纯化问题！！！！求助啊 ！！！
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做融合蛋白的分离纯化，第一次纯化以1ml破菌后的融合蛋白溶液：0.4ml的亲和层析树脂进行纯化去除杂蛋白，基本可以洗脱完全杂蛋白，这亲和树脂的量是足够的。然后将洗脱的融合蛋白进行透析复性，冷冻干燥。 通过其羟胺裂解位点来裂解开目的蛋白和载体蛋白。。。羟胺裂解由于效率不高，故其还有剩余的融合蛋白，所以裂解后电泳的条带就有三条了：未裂解的融合蛋白、载体蛋白和目的蛋白。现在进行二次过亲和层析柱，因为参照前面第一次纯化，羟胺裂解，理应这羟胺裂解蛋白浓度是比第一次纯化时蛋白要低的，可按照这个裂解后的溶液按照1ml裂解液：0.4ml亲和层析树脂进行二次纯化，可洗脱下来的就是不单单只有目的蛋白啊 ！！！这怎么回事呢？麻烦各位懂的大虾们帮小弟解答下！！！谢谢啊！！！ |
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imfly77
木虫 (小有名气)
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如果是我做这个实验的话。 我设计的融合蛋白是“目的蛋白-羟胺位点-Histag” 有两种方案： （1）第一次亲和纯化后从柱子上获得纯化的“目的蛋白-羟胺位点-Histag” 通过羟胺切割，获得目的蛋白、Histag、以及没有切割的“目的蛋白-羟胺位点-Histag” 第二次亲和纯化，利用Ni或Co柱特异性结合掉Histag和没有切割的“目的蛋白-羟胺位点-Histag”，从穿透峰里获得纯化的目的蛋白——风险是还是可能会有没有结合的杂蛋白。 （2）过亲和柱子，不洗脱，而是直接在柱子上原位进行羟胺裂解——我没做过羟胺裂解，所以不知道是否会影响结合，你可以查下相关文献 第一次洗脱，得到切下来的目的蛋白 第二次洗脱，得到没有切割的没有切割的“目的蛋白-羟胺位点-Histag”以及Histag。 这样只需要过一次亲和柱，不知道我理解的是不是对不对？ |
7楼2011-08-29 14:32:28
2楼2011-08-28 11:14:28
冼亮淀粉酶
专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
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