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njunkai

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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在线: 7小时
虫号: 1069519
注册: 2010-08-04
专业: 蛋白质组学

[求助] 进行羟胺裂解后，进行蛋白的二次过亲和层析住纯化问题！！！！求助啊！！！

做融合蛋白的分离纯化，第一次纯化以1ml破菌后的融合蛋白溶液：0.4ml的亲和层析树脂进行纯化去除杂蛋白，基本可以洗脱完全杂蛋白，这亲和树脂的量是足够的。然后将洗脱的融合蛋白进行透析复性，冷冻干燥。
通过其羟胺裂解位点来裂解开目的蛋白和载体蛋白。。。羟胺裂解由于效率不高，故其还有剩余的融合蛋白，所以裂解后电泳的条带就有三条了：未裂解的融合蛋白、载体蛋白和目的蛋白。现在进行二次过亲和层析柱，因为参照前面第一次纯化，羟胺裂解，理应这羟胺裂解蛋白浓度是比第一次纯化时蛋白要低的，可按照这个裂解后的溶液按照1ml裂解液：0.4ml亲和层析树脂进行二次纯化，可洗脱下来的就是不单单只有目的蛋白啊！！！这怎么回事呢？麻烦各位懂的大虾们帮小弟解答下！！！谢谢啊！！！

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1楼 2011-08-28 11:13:44

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xiehe_ai

金虫 (著名写手)

额

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
adslye(金币+3): 很认真，鼓励认真，鼓励继续深入讨论！ 2011-08-29 09:50:22

不是很了解融合蛋白的纯化。
不知你那亲和胶是什么胶，配体是什么。也不知道你二次纯化后杂蛋白是多还是微量。
有没有这种可能：没有裂解的融合蛋白和目的蛋白一起挂柱再被洗脱，造成你的二次纯化不纯。
还有你用的胶蛋白配体会不会有脱落。有时亲和胶用太久了或胶本身就不好的话，会有配体脱落的现象。若配体是蛋白且有脱落，肯定不纯了。不过这种情况应该是痕量的，第一种可能性大些。