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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 进行羟胺裂解后，进行蛋白的二次过亲和层析住纯化问题！！！！求助啊 ！！！
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njunkai

新虫 (初入文坛)

[求助] 进行羟胺裂解后，进行蛋白的二次过亲和层析住纯化问题！！！！求助啊 ！！！

做融合蛋白的分离纯化，第一次纯化以1ml破菌后的融合蛋白溶液：0.4ml的亲和层析树脂进行纯化去除杂蛋白，基本可以洗脱完全杂蛋白，这亲和树脂的量是足够的。然后将洗脱的融合蛋白进行透析复性，冷冻干燥。
通过其羟胺裂解位点来裂解开目的蛋白和载体蛋白。。。羟胺裂解由于效率不高，故其还有剩余的融合蛋白，所以裂解后电泳的条带就有三条了：未裂解的融合蛋白、载体蛋白和目的蛋白。现在进行二次过亲和层析柱，因为参照前面第一次纯化，羟胺裂解，理应这羟胺裂解蛋白浓度是比第一次纯化时蛋白要低的，可按照这个裂解后的溶液按照1ml裂解液：0.4ml亲和层析树脂进行二次纯化，可洗脱下来的就是不单单只有目的蛋白啊 ！！！这怎么回事呢？麻烦各位懂的大虾们帮小弟解答下！！！谢谢啊！！！
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1楼 2011-08-28 11:13:44
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njunkai

新虫 (初入文坛)
是用Ni树脂和Co树脂亲和层析呢，HIS-tag。。。有人说会不会羟胺对其挂柱结合有影响？
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6楼2011-08-29 09:33:18
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njunkai

新虫 (初入文坛)
还是自己沙发！！！各位有做这一块的辛苦你们给我解释下！！！很纠结额啊！！！
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2楼2011-08-28 11:14:28
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
adslye(金币+2): 感谢专家点评~~嘿嘿~~看你头像，是指弹？还是弹唱？ 2011-08-28 18:14:12
有标签的就能结合，你想一下哪个有标签
赞一下(1人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2011-08-28 15:57:31
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xiehe_ai

金虫 (著名写手)

额

【答案】应助回帖

★ ★ ★
adslye(金币+3): 很认真，鼓励认真，鼓励继续深入讨论！ 2011-08-29 09:50:22
不是很了解融合蛋白的纯化。
不知你那亲和胶是什么胶，配体是什么。也不知道你二次纯化后杂蛋白是多还是微量。
有没有这种可能：没有裂解的融合蛋白和目的蛋白一起挂柱再被洗脱，造成你的二次纯化不纯。
还有你用的胶蛋白配体会不会有脱落。有时亲和胶用太久了或胶本身就不好的话，会有配体脱落的现象。若配体是蛋白且有脱落，肯定不纯了。不过这种情况应该是痕量的，第一种可能性大些。
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夫天地者,万物之逆旅也；光阴者,百代之过客也。而浮生若梦，为欢几何？古人秉烛夜游，良有以也。况阳春召我以烟景，大块假我以文章。
4楼2011-08-28 19:15:02
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