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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 考马斯亮蓝法测蛋白含量时吸光度A595nm为负值！！！求助
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huazi5853

银虫 (初入文坛)

[求助] 考马斯亮蓝法测蛋白含量时吸光度A595nm为负值！！！求助

小弟用内含4mol/L NaCl 的0.05M Tris-HCl 缓冲液去除猪皮中的非胶原蛋白，4℃条件下处理24h，取滤液，用考马斯亮蓝法测滤液中蛋白含量，以蒸馏水为空白样，测A595nm，结果发现待测液波长是负值，很迷惑，求大侠指点，谢谢！！
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十年修得同船渡
1楼 2011-08-26 16:17:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

dannyboy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
huazi5853(金币+5): 嗯 谢谢 2011-08-28 10:06:31
adslye(金币+3): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-28 14:01:45
空白应该用你所用的缓冲液才不会出现负值！
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7楼2011-08-28 08:58:44
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dannyboy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
adslye(金币+1): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-29 10:03:54
huazi5853(金币+3): 2011-08-30 08:10:45
空白也应该是用你的缓冲液，标准曲线最好也应该是你的缓冲液溶解的标准蛋白。只有这样误差才是最小的。
赞一下(3人) 回复此楼
9楼2011-08-28 19:34:51
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普通回帖

xilababy

木虫 (小有名气)

圣斗士

【答案】应助回帖

★ ★ ★
huazi5853(金币+6): 非常感谢：） 2011-08-27 10:08:17
lstt09nk(金币+3): 鼓励参与 2011-08-27 10:37:14
silicare(BioEPI+1): 2011-11-07 14:51:45
为什么不用你的Tris溶液做空白呢   Tris会影响考马斯亮蓝的测试结果的  但影响不大  我之前也碰到这种情况  一开始是因为考马斯亮蓝放太久了，染色能力不行了，所以微量的蛋白浓度时检测不到的，ABS也为负，后来换了考马斯亮蓝结果好了很多，只要蛋白浓度不低于0.01mg/ml 就不会为负值
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加油文章毕业偶也
2楼2011-08-27 09:04:22
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xilababy

木虫 (小有名气)

圣斗士
我是用Tris作空白
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加油文章毕业偶也
3楼2011-08-27 09:05:07
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protein_

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-08-27 10:37:25
huazi5853(金币+4): 嗯 好 谢谢你：） 2011-08-28 10:05:41
silicare(BioEPI+1): 2011-11-07 14:52:05
你用你的考马斯亮蓝原液做空白试试，  除非你的蛋白里面没有疏水基团，毕竟考马斯亮蓝测蛋白局限性很大，真不行就定氮
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4楼2011-08-27 10:20:51
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2, BioEPI+1): 鼓励应助 2011-08-28 13:06:04
引用回帖:
1楼: Originally posted by huazi5853 at 2011-08-26 16:17:19:
小弟用内含4mol/L NaCl 的0.05M Tris-HCl 缓冲液去除猪皮中的非胶原蛋白，4℃条件下处理24h，取滤液，用考马斯亮蓝法测滤液中蛋白含量，以蒸馏水为空白样，测A595nm，结果发现待测液波长是负值，很迷惑，求大侠指 ...

我用BCA法的，感觉线性范围比较大，比考染大多了。图中横轴是BSA含量，微克，纵轴是OD562与空白对照的差值。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2011-08-28 02:05:18
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

huazi5853(金币+2): 谢谢 2011-08-28 10:06:41
考马斯亮蓝法要求蛋白浓度高
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6楼2011-08-28 08:54:01
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huazi5853

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by dannyboy at 2011-08-28 08:58:44:
空白应该用你所用的缓冲液才不会出现负值！

可是 在这之前 标准曲线所用的空白样 是用蒸馏水做的。  
如果以缓冲液作空白去测定吸光度，并将吸光度值代入标准曲线求其蛋白浓度。前后空白样不一样 这样可以吗
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十年修得同船渡
8楼2011-08-28 10:09:26
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ecustwyy

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2011-11-07 13:37:04
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