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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 离子交换层析（deae-纤维素）出峰差异很大（有图谱）
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liuliancy

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 离子交换层析（deae-纤维素）出峰差异很大（有图谱）

昨天用DEAE-纤维素过柱子，图谱如1，目标蛋白跟杂蛋白差没分开，今天用相同的缓冲液相同的上样量和样品，结果却一点都没分开，柱子1*20，上样2ml，梯度洗脱液为50mL 20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，得到的图谱却是2和3的样子，请教各位长辈这是为什么？洗脱液要怎么调节才能将得到较好的洗脱效果？
                             图1

                                                  图2

                                                  图3


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1楼 2011-08-17 20:54:08
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2, BioEPI+1): 鼓励经典~祝顺利！ 2011-08-18 09:20:19
liuliancy(金币+3): 感谢老大！！！ 2011-08-18 09:27:20
1、我没听说过Tris-醋酸这个缓冲液，你有没有试过Tris-盐酸缓冲液？

2、你的两个洗脱液用的是20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，看来你是想用pH梯度和离子强度一起来制造一个洗脱梯度，这样做有什么依据吗？我认为这样会引入误差，因为两个因素制造的梯度可控制性可能会弱于一个因素。如果用pH值，不知道稍低的pH值会不会引起蛋白质失活，所以我喜欢用离子强度作为洗脱梯度，起始缓冲液和洗脱缓冲液的pH值相同，但是氯化钠分别为0和1M，能制作出一条从0-1M的连续线性梯度。这样结果也更好分析。

3、两个峰即使是顶点能分开，但交叉很大也是不纯的。DEAE在我的实验里分离效果差，比不上其它的阴离子交换层析柱，如果有别的层析柱，也可以联用。

4、层析柱1*20没有意义，计算柱体积才有意义。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
2楼2011-08-18 00:06:28
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liuliancy

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-08-18 00:06:28:
1、我没听说过Tris-醋酸这个缓冲液，你有没有试过Tris-盐酸缓冲液？

2、你的两个洗脱液用的是20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，看来你是想用pH梯度和 ...

感谢老大了！！不过Tris-醋酸我也是第一次听说，一个文献上的洗脱条件，这些东西也都是第一次用所有很多不太了解，用Tris-Hcl氯化钠分别为0和1M梯度试试，不知道老大能不能推荐几个阴离子交换层析柱，我做的是SOD（超氧化物歧化酶），再次感谢！！
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3楼2011-08-18 09:35:05
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alexlv

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
liuliancy(金币+1): 不要盯着一个柱子？难道要几个一起？ 2011-08-18 13:16:05
adslye(金币+1): 感谢交流~祝顺利！ 2011-08-18 19:22:52
控制好洗脱梯度和体积，以及PH，当然不要盯着一个柱子。
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4楼2011-08-18 12:06:14
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
你方不方便先试一下我说的条件，大概会花一天，再把结果发上来。
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5楼2011-08-19 00:47:10
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btx362237729

金虫 (正式写手)
这个要学习一下
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人生最黑暗的时光终于过去了
6楼2011-08-19 12:17:49
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liuliancy

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-08-19 00:47:10:
你方不方便先试一下我说的条件，大概会花一天，再把结果发上来。

做了下，分别用20mM tris-乙酸ph7.5和50mM tris-乙酸ph5.0（含NaCl 0.3M）、20mM tris-hcl ph7.5和20mM tris-hcl ph7.5（含NaCl 1M）、20mM tris-hcl ph7.8和20mM tris-hcl ph7.8（含NaCl 0.8M）、20mM tris-hcl ph7.2和20mM tris-hcl ph7.2（含NaCl 0.8M）图谱如下：
20mM tris-乙酸ph7.5和50mM tris-乙酸ph5.0（含NaCl 0.3M）

20mM tris-hcl ph7.5和20mM tris-hcl ph7.5（含NaCl 1M）

20mM tris-hcl ph7.8和20mM tris-hcl ph7.8（含NaCl 0.8M）

20mM tris-hcl ph7.2和20mM tris-hcl ph7.2（含NaCl 0.8M）


请指教！
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7楼2011-08-19 20:32:19
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
做得很好，我有两个问题：酶活力在哪里；横轴的0是不是开始进入0-100%洗脱梯度，是不是不包括上样和平衡，如果包括，那么洗脱时间是从哪里到哪里？
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8楼2011-08-19 21:32:30
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liuliancy

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-08-19 21:32:30:
做得很好，我有两个问题：酶活力在哪里；横轴的0是不是开始进入0-100%洗脱梯度，是不是不包括上样和平衡，如果包括，那么洗脱时间是从哪里到哪里？

酶活都是第三个峰，前面的两个都是杂质；横轴的0就是直接上好样后进入0-100%梯度洗脱的，把平衡的也算在内了，也就是加样后没平衡直接梯度的，这样不行吗？
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9楼2011-08-19 21:55:34
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xiehe_ai

金虫 (著名写手)

额
我最近也遇到一个问题，改天我也把图截过来，大家帮我分析分析是怎么回事
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夫天地者,万物之逆旅也；光阴者,百代之过客也。而浮生若梦，为欢几何？古人秉烛夜游，良有以也。况阳春召我以烟景，大块假我以文章。
10楼2011-08-20 00:21:13
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